镇江地区2018年不同来源副溶血性弧菌毒力基因及耐药性分析*

许金凤，曹文婷，张潇丹，巢秀琴，宋寅生，徐虹

(镇江市疾病预防控制中心检验科，江苏镇江 212000)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一种噬盐菌，是我国大陆沿海地区食物中毒中最常见的一种病原菌，也是引发胃肠炎等食源性疾病的主要致病菌之一[1]。镇江地处长江沿岸，由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件多有发生[2]。副溶血性弧菌的主要致病因子是溶血素，分别由tlh、tdh和trh基因编码不耐热溶血素、耐热直接溶血素和耐热直接溶血素相关溶血素[3]。其中tdh和trh为毒力基因，具有溶血毒性、细胞毒性、心脏毒性和肠毒性[4]。为了解镇江地区食品及疾病患者中副溶血性弧菌的检测情况以及毒力基因和耐药性差异，本研究就镇江地区2018年食品水产品及食源性疾病病例检出的副溶血性弧菌进行比较，旨在为副溶血性弧菌的研究提供一定的数据基础。

1 材料与方法

1.1样本来源 2018年镇江地区食品微生物及其致病因子监测的水产品35份(采集时间为5月—10月；个体较大水产品以一个个体为单位单独取样，个体较小的鱼类、虾、蟹等，混合采取样品，取样部位为内容物，应包括肠、消化腺)，食源性疾病监测的病例样本608份；食品采样环节包括流通环节(批发市场、农贸市场、超市等)和餐饮服务环节(大中小型餐馆、小吃店)；病例监测包含润州区、丹徒区、丹阳市、句容市4个地区的哨点医院，监测的致病菌包括沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌和致泻性大肠埃希菌4种。

1.2主要试剂及仪器 弧菌显色培养基(法国科玛嘉公司)，TCBS培养基(北京陆桥生物技术公司)，肠杆菌和其他非苛养革兰阴性杆菌鉴定试剂盒API 20E(法国生物梅里埃公司)，副溶血性弧菌tlh/tdh/trh三重实时荧光PCR检测试剂盒、细菌DNA提取试剂盒(北京卓诚惠生生物科技公司)；全自动药敏加样判读系统及阴性药敏板、生物安全柜(美国赛默飞公司)，ABI 7500荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.3菌株分离鉴定 样品处理、副溶血性弧菌的检测鉴定均参照《GB 4789.7-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》[5]进行，所有菌株用API 20E生化鉴定试纸条进行生化鉴定，并经德国Bruker MTP384 MALDI-TOF MS飞行时间质谱仪确认为副溶血性弧菌。

1.4毒力基因检测 采用金属浴加热法提取副溶血性弧菌DNA：挑取新鲜纯培养菌落至1 mL灭菌ddH2O比浊管中，调至0.5麦氏浊度单位后转移至EP管，13 000 r/min离心3 min，弃上清液。加入50 μL核酸提取液，100 ℃金属浴加热10 min，13 000 r/min离心10 min，取上清液为PCR模板，-20 ℃保存备用。采用副溶血性弧菌tlh/tdh/trh三重实时荧光PCR检测试剂盒进行不耐热溶血素基因(tlh)、耐热直接溶血毒素基因(tdh)和耐热相关溶血毒素基因(trh)3种基因检测。检测方法详见试剂盒说明书。

1.5药敏试验 采用微量肉汤法，根据美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2018版M100[6]和国家食品安全风险评估中心《2018年国家食源性疾病监测工作手册》[7]食源性致病菌药敏试验标准操作程序，对副溶血性弧菌进行11类15种抗菌药物检测：氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑啉、头孢他啶、头孢噻肟、头孢西丁、亚胺培南、庆大霉素、红霉素、阿奇霉素、四环素、氯霉素、萘啶酸、环丙沙星、复方磺胺甲噁唑。药敏试验操作和结果判读严格按照说明书进行。以对3类及以上抗菌药物同时耐药定义为多重耐药[8]。以大肠埃希菌ATCC 25922作为药敏质控菌株。

1.6统计学分析 用SPSS 18.0统计软件进行。对阳性率进行χ2检验(当n<40，或T<1时，需用Fisher确切概率法)，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1食品来源及疾病来源的副溶血性弧菌的检出率 2018年镇江地区进行副溶血性弧菌检测的相关食品35份，检出副溶血性弧菌21份，检出率为60.00%；食源性疾病病例608例，检出副溶血性弧菌9例，检出率为1.48%。食品来源和疾病来源检出率差异有统计学意义(χ2=241.82，P<0.01)。食品采样环节覆盖流通环节和餐饮服务环节，检出率分别为53.85%(14/26)和77.78%(7/9)，差异无统计学意义(χ2=1.60，P>0.05)。食源性疾病监测的润州区、丹徒区、丹阳市、句容市4个地区副溶血弧菌检出率分别为0%(0/152)、1.92%(3/156)、2.67%(4/150)和1.33%(2/150)，差异无统计学意义(χ2=3.96，P>0.05)；食源性疾病4种致病菌中副溶血性弧菌占比为36.00%(9/25)，低于沙门菌(52.00%)，高于志贺菌(12.00%)和致泻性大肠埃希菌(0)。

2.2不同来源副溶血性弧菌毒力基因阳性率 来自食品的菌株(简称食品株)和来自疾病患者的菌株(简称疾病株)tlh基因均阳性；食品株tdh基因阳性率为0，疾病株为88.89%，差异有统计学意义(χ2=25.45，P<0.01)；食品株trh基因阳性率为0，疾病株阳性率为11.11%，差异无统计学意义(χ2=2.41，P>0.05)。

2.3不同来源副溶血性弧菌耐药情况 30株副溶血性弧菌，无任何一菌株对15种抗菌药物全部敏感；食品株与疾病株对头孢唑啉均耐药(100.00%，30/30)；疾病菌株对氨苄西林和红霉素的耐药率(88.89%)高于食品株(66.67%)，差异均无统计学意义(χ2=1.59，P>0.05)；另在食品中检出耐萘啶酸菌株2株(9.52%)，耐头孢他啶菌株1株(4.76%)。见表1。耐3类及以上的多重耐药菌为18株，多重耐药率为60.00%(18/30)，疾病株的多重耐药率(77.78%，7/9)高于食品株(52.38%，11/21)。食品株与疾病株均以氨苄西林+头孢唑啉+红霉素多重耐药谱占比最高，其次分别为头孢唑啉+红霉素和氨苄西林+头孢唑啉，单一耐药以头孢唑啉为主。

表1镇江地区2018年不同来源副溶血性弧菌耐药结果[n(%)]

抗菌药物食品株耐药疾病株耐药合计氨苄西林14(66.67)8(88.89)22(73.33)氨苄西林/舒巴坦0(0)0(0)0(0)头孢唑啉21(100.00)9(100.00)30(100.00)头孢他啶1(4.76)0(0)1(3.33)头孢噻肟0(0)0(0)0(0)头孢西丁0(0)0(0)0(0)亚胺培南0(0)0(0)0(0)庆大霉素0(0)0(0)0(0)红霉素14(66.67)8(88.89)22(73.33)阿奇霉素0(0)0(0)0(0)四环素0(0)0(0)0(0)氯霉素0(0)0(0)0(0)萘啶酸2(9.52)0(0)2(6.67)环丙沙星0(0)0(0)0(0)复方磺胺甲噁唑0(0)0(0)0(0)

3 讨论

镇江地区2018年水产品中副溶血性弧菌检出率为60.00%，高于江苏省其他城市[1]及省平均水平[8]，由食品污染引起感染的概率大大增加；本地区食源性疾病中副溶血性弧菌检出率为1.48%，占所检致病菌总数的36.00%，可见副溶血性弧菌是本地区食源性疾病的主要致病菌之一。镇江地处长江沿岸，东接沿海城市及东海和黄海，其污染率之高及食源性疾病时有发生的情况提示可能与其地理位置及交通便利密切相关，下一步应加强水源等的监测。

分子流行病学研究表明携带tdh、trh毒力基因的产毒株与人类食源性疾病的暴发密切相关[9]。tlh溶血素基因本身不具溶血活性，是副溶血性弧菌的一种特异性基因[8-9]。本研究30株副溶血性弧菌tlh基因均阳性，与文献报道相符。食品株均未检出tdh和trh毒力基因，一方面由于样本量少，另一方面可能与食品株经过人体的进一步转化产生毒力，进而变成产毒株有关。疾病株携带tdh和trh基因情况有差异，其中tdh基因的阳性率显著高于trh基因，也更加验证了tdh基因可作为Vp致病性的可靠分子标志物。

本次监测显示副溶血性弧菌对15种抗菌药物有不同程度耐药，食品株和疾病株对头孢唑啉均100.00%耐药，远高于本地区2015年副溶血性弧菌的耐药监测结果[10]和江苏省2015—2017年副溶血性弧菌的耐药率[8]。疾病株对氨苄西林和红霉素的耐药率及多重耐药率均高于食品株，与蔡彦秋等[1]的研究结果一致。综上，说明不同来源的副溶血性弧菌对常用抗菌药物的耐药程度均呈上升趋势，多重耐药率及耐药谱不尽相同[11-12]，多重耐药谱以氨苄西林+头孢唑啉+红霉素为主。

本研究发现不同来源的副溶血性弧菌的病原分离、产毒性及耐药性存在差异，为副溶血性弧菌导致的食源性疾病的防控提供指导。在下一步的研究中，应加大水产品的检测，扩大药敏监测种类，联合应用副溶血性弧菌的脉冲场凝胶电泳及多位点序列分型等技术，从分子特征方面研究食品株与疾病株、产毒株与非产毒株的差异，也为防止副溶血性弧菌引起的突发事件做好保障。