臭氧熏蒸处理联合PE 包装对金针菇采后贮藏品质 及抗氧化能力的影响

王霆，张雨，刘宏，何田田，毕阳，贠建民

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，兰州 730070）

0 引言

【研究意义】随着全球食用菌产业发展和消费大幅度增加，食用菌产业已成为全球农业种植业中继粮食、蔬菜、果树、油料之后的第五大产业，采后贮藏流通总量呈逐年上升趋势[1]。金针菇（Flammulina velutipes）因其味道鲜美、营养价值高，深受各国人们青睐，已成为食用菌中的大宗品种[2]。但鲜金针菇含水量高，组织脆嫩，在采后贮藏期间易出现失水、菌盖开伞、萎蔫、菌柄伸长、褐变、产生异味等现象，严重影响了金针菇的商品价值。因此，探索一种有效的保鲜方法来延缓金针菇在储藏期间的品质劣变，对延长货架期具有重要意义。【前人研究进展】臭氧因具有强氧化作用，能够抑制霉菌孢子产生[3-4]；臭氧易分解，不易造成残留[5-6]；安全性较高，是一种新型、绿色保鲜剂[7]。已有研究表明，臭氧处理金橘[8]、草莓[9-10]和竹笋[11]等果蔬，能够抑制果蔬的呼吸作用，并通过清除呼吸作用产生的乙烯，从而延缓果蔬的衰老。食用菌采后在常温条件下的贮藏期非常短，由于它组织脆嫩，表皮缺乏保护层，采后受到物理损伤、微生物侵染和水分损失[12-13]导致其品质劣变非常快，使其商品价值大大的缩减。研究表明食用菌采后衰老通常与活性氧含量的升高，蛋白质、脂类和核酸的氧化损伤增加有关，因此，贮藏期间严格控制其活性氧含量的升高和抑制其氧化的发生[14]，对食用菌的保鲜贮藏有重大意义。金针菇采后贮藏可被认为是一种非生物胁迫，因为贮藏条件与生长条件有很大的不同，可能导致子实体细胞内电子传递受阻以及活性氧含量的积累[15]，当活性氧积累的量超过中和它们防御机制的能力时，导致“氧化应激”[16]，从而导致脂质和蛋白质的氧化，酶活性受到抑制以及细胞和细胞器膜的损伤。【本研究切入点】目前国内外采用臭氧处理金针菇的报道很少。本研究通过测定金针菇在贮藏期间的感官变化以及系列品质和抗氧化活性指标变化，综合分析评价臭氧熏蒸处理联合PE 包装对金针菇采后品质劣变规律，以及对贮藏期间的活性氧（ROS）积累及抗氧化能力的影响。【拟解决的关键问题】本研究以工厂化生产的金针菇为供试材料，基于常规低温冷藏模式，筛选臭氧贮藏条件，为金针菇采后流通环节减损保质提供方法参考和依据。

1 材料与试剂

试验于2019 年5—6 月在甘肃农业大学食品科学与工程学院食品微生物实验室进行。

1.1 试验材料

试验所用金针菇（Flammulina velutipes），为日本白金品系，采自天水众兴菌业科技股份有限公司。低温（4±1℃）预冷24 h 后，挑选菇体均一、色泽一致、朵型完整、菇盖圆润、无损伤的金针菇作为试验材料。

1.2 试验试剂

聚乙二醇6000（PEG 6000）、硫代巴比妥酸、甲醇、丙酮、四氯化钛、30%过氧化氢、氮蓝四唑（NBT）、核黄素、L-蛋氨酸（MET）、α-萘胺、盐酸羟胺、氨基苯磺酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、交链聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、邻苯二酚、亚硝酸钾，均为分析纯，天津光复精细化工研究所生产。

1.3 仪器与设备

OSAN CFC 臭氧发生器（10 g·h-1），大连奥山环保科技有限公司；UV756CRT 紫外-可见分光光度计，上海佑科仪表有限公司；JFQ-3150H 果蔬呼吸仪，北京均方理化科技研究所；THZ-98A 恒温振荡器，上海一恒科学仪器有限公司；PHS-3CpH 计，上海佑科仪器仪表有限公司；101-1-S-Ⅱ电热恒温培养箱，北京科伟永兴仪器有限公司；DDS-307A 电导率仪，上海仪电科学仪器股份有限公司；Ci6x 分光光度仪，美国X-Rite。

表1 金针菇感官评定标准Table 1 Flammulina velutipes sensory evaluation standard

1.4 方法

1.4.1 臭氧熏蒸处理 将预冷后的金针菇按照（180± 10）g 平放于干净的聚乙烯塑料筐内，容积为5 m3（规格：10 cm×25 cm×20 cm），共计180 筐；将装有金针菇的塑料筐置于体积20.5 m3的冷库中（温度为（8±1）℃、相对湿度85%—90%），按“三离一隙”的原则双层摆放于距离地面30 cm 的架板上；将臭氧发生器通过预冷装置连接到冷库中，对金针菇进行熏蒸处理，经过熏蒸处理后用聚乙烯（PE）保鲜薄膜将每个筐进行密封包裹，进行最佳臭氧熏蒸浓度和时间的筛选；然后利用预筛选的最佳处理浓度和时间，在低温（4±1℃）条件下进行贮藏试验，同时以“不熏蒸+不密封”和“不熏蒸+密封”作为双对照组（分别记作CK、CKPE）。

1.4.2 最适熏蒸浓度和时间的筛选试验 通过控制臭氧发生器（10 g·h-1）开机的时间来控制臭氧浓度，设置1.356 mg·m-3（100 s）、2.711 mg·m-3（200 s）和4.066 mg·m-3（300 s）3 个浓度梯度的臭氧，在温度为（8±1）℃、相对湿度为85%—90%的冷库中分别对金针菇样品进行10、15 和20 min 的组合熏蒸处理，开展最佳熏蒸处理浓度和时间的筛选。每3 d 对感官评分、褐变指数、失重率3 项指标进行取样测定，测定至12 d，每个处理组设置3 次重复。

1.4.2.1 感官评价 参照张琪等[17]方法，有所修改。评价标准详见表1。

1.4.2.2 褐变指数（BI）测定 参照GAO 等[18]和FERNANDES 等[19]的方法，采用Ci6x 便携式分光光度仪于待测金针菇菇盖测定色差3 次，L表示亮度，a正值表示偏红，负值表示偏绿；b 正值表示偏黄，负值表示偏蓝；测定结果与标准颜色（L0、a0、b0）进行比较，以ΔE 表示菌体整体颜色变化，每3 d 测定1 次。

∆E 是整体颜色变化的程度，并遵循公式计算

褐变指数（BI）的计算公式如下

1.4.2.3 失重率测定 失重率的测定采用重量法[20]。

1.4.3 低温贮藏试验 采用筛选出的最优臭氧熏蒸浓度和处理时间对金针菇进行熏蒸处理后，PE 保鲜薄膜包装，在（4±1）℃低温、85%—90%湿度的冷库中贮藏，然后用消毒牙签在密闭框的PE 保鲜膜上均匀戳6—8 个小孔，防止长期密封使子实体发生无氧呼吸，每隔3 d 对金针菇的感官评分，失重率、呼吸强度、褐变指数、菌落总数、丙二醛（MDA）、超氧阴离子（）、过氧化氢（H2O2），以及过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）进行取样测定，测定至21 d。

1.4.3.1 呼吸强度的测定 参照胡培芳等[21]的方法，采用JFQ-3150H 型果蔬呼吸仪测定，气体流速500 mL·min-1。各处理组间的金针菇重量为160±5 g，3 次重复。

1.4.3.2 相对电导率的测定 参照BARMAN 等[22]的方法。取金针菇菇柄、菇盖混合样品5.00 g 置于锥形瓶中，加入40 mL 蒸馏水，摇晃后立刻以DDS-307A型电导率仪测定电导率值P0，10 min 后测定电导率值P1；然后煮沸10 min，冷却至室温后用蒸馏水补齐至40 mL，测定电导率值P2。按下面公式计算样品的相对电导率：

1.4.3.3 菌落总数测定 取金针菇子实体样品10 g，投入90 mL 无菌生理盐水中，在120 r/min、37℃条件下振荡培养30 min，制备10-1菌悬液，参照GB4789.2— 2016 测定金针菇表面菌落总数[23]。

1.4.3.4 MDA 含量的测定 参照曹建康等[24]的方法，采用分光光度法进行MDA 的测定，分别在450 nm、532 nm、600 nm 波长处测定吸光值。记录数据，用下 列公式计算：

式中，C：反应混合液中丙二醛的浓度（μmol·L-1）；V：样品提取液总体积（mL）；m：样品质量（g）；VS：测定时所取样品提取液体积（mL）。

1.4.3.5 超氧阴离子生成速率 参照ELSTNER等[25]的方法。取2 g 样品，加5 mL 0.l mol·L-1磷酸缓冲液（pH=7.8，含100 μmol·L-1EDTA 和1% PVPP），冰浴研磨，4℃、1 000 r/min 低温离心15 min，取1.0 mL上清液，与1.0 mL 盐酸羟胺混匀，37℃水浴60 min，加入l.0 mL 对氨基苯磺酸和1.0 mLa-奈胺，混匀，显色10 min，测定A530。以NaNO2溶液作亚硝酸根标准曲线，按下式计算：

式中，A：羟胺氧化反应产生的NaNO2（μmol）；V1：样品提取液总体积（mL）；V2：酶液体积（mL）；FW：样品鲜重（g）；t：时间（min）。

1.4.3.6 H2O2含量的测定 参照PATTERSON 等[26]的方法。取2 g 样品，加5 mL 4℃下预冷的丙酮和少许石英砂，研磨，4℃、10 000 r/min 低温离心15 min，取1 mL 上清液加0.1 mL 四氯化钛（TiCl4）的浓盐酸溶液和0.2 mL 浓氨水，生成的复合物于10 000 r/min离心15 min，将沉淀溶于3 mL H2SO4中，410 nm 波长测吸光值。以过氧化氢作标准曲线并计算过氧化氢含量（μmol·g-1FW）。

1.4.3.7 SOD 活性测定 参考ZHANG 等[27]的方法。提取液的制备：取2 g 样品，加5 mL 0.1 mol·L-1硼酸硼砂缓冲液（pH=7.8，含1% PVPP），冰浴研磨，4℃、10 000 r/min 离心15 min，取上清液测定酶活性。反应体系：按序依次加入2.4 mL 0.1 mol·L-1硼酸硼砂缓冲液（pH8.7），0.2 mL 130 mmol·L-1甲硫氨酸，0.2 mL 100 μmol·L-1EDTA，0.1 mL 粗酶提取液，0.2 mL 750 μmol·L-1NBT，0.1 mL 20 μmol·L-1核黄素，用缓冲液代替酶液作空白，试剂全部加完后充分混匀。做3 支空白管，其中一支置于暗处，其他两支及测定管均在光强为400 lx 的日光灯下光照1 h，然后立即遮光停止反应，以暗处放置的空白管调零，测定A560。以不加酶液的试管为最大还原管，以1 h 内抑制NBT光还原50%的酶液量为一个酶活单位（U），酶活性计算： 式中，A0：最大还原管的吸光度；AS：样品管吸光度；V1：粗酶液提取体积（mL）；V2：测定时取粗酶液量（mL）；t：反应时间（h）；FW：样品鲜重（g）。 1.4.3.8 CAT 活性测定 参考AEBI[28]的方法。提取液制备：取2 g 样品，加入5 mL 0.1 mol·L-1硼酸硼砂缓冲液（pH=7.8，含1% PVPP），冰浴研磨，4℃、10 000 r/min 低温离心15 min，取上清液测定酶活性。反应体系：取0.2 mL 粗酶提取液，加入3 mL磷酸缓冲液（0.05 mol·L-1，pH=7.0）、0.2 mL 0.75% H2O2，扫描3 min 内A240的变化，以每min 240 nm处吸光值下降0.001 作为一个酶活单位（U）；酶活性以U·g-1FW 表示。

1.5 数据分析

测定均重复3 次，取平均值，试验数据用Microsoft Excel 2007 计算标准偏差，采用SPSS 20.0 进行方差分析，用Duncan’s 多重差异显著分析；并用Origin 8.0作图。

2 结果

2.1 臭氧熏蒸最优保鲜剂量筛选结果

由表2 可知，金针菇菇体在低温贮藏过程中随着贮藏时间的延长感官品质发生劣变，感官评分不断下降，表现在菇体褐变越来越严重，褐变指数不断升高，失重率也越来越高。对照组在贮藏第12 天时，大部分子实体菇盖凹陷、根部及菇盖发黄，感官评分、褐变指数、失重率分别达到78.69 分、33.86、3.42%，已经失去了一定的商品价值。而经2.711 mg·m-3臭氧熏蒸处理15 min 的金针菇子实体在第12 时，感官评分仍为82.31 分，褐变指数为19.91，失重率为2.27%，均显著优于对照组（P＜0.05）。因此，2.711 mg·m-3的臭氧熏蒸处理15 min 是金针菇保鲜最佳处理剂量。

图1 臭氧熏蒸处理对金针菇品质的影响Fig. 1 Effects of ozone fumigation on quality of Flammulina velutipes

2.2 臭氧熏蒸处理保鲜贮藏试验结果

2.2.1 对金针菇贮藏品质的影响 金针菇贮藏期间感官品质变化及感官评分结果见图1 和图2。对照组和臭氧处理组的感官品质和感官评分的动态变化趋势基本一致，均表现为持续下降。处理组菇体随贮藏时间延长而逐渐变黄、萎蔫，菇柄顶端出现生长、弯曲，根部发黏；且在第6—21 天，处理组金针菇的感官评分显著高于对照组（CKPE）（P＜0.05），第6、12、15、18 和21 天，处理组比对照组（CKPE）分别高3.8%、4.3%、3.7%、3.6%、4.7%，说明臭氧熏蒸处理减缓了金针菇感官品质的劣变，延缓了金针菇的衰老。

表2 臭氧熏蒸对保鲜金针菇菇体感官品质、褐变指数及失重率的影响Table 2 Effect of ozone fumigation on sensory score browning index and weightlessness of Flammulina velutipes under low temperature

金针菇在贮藏期间的品质变化可以直观地反映在菇盖色泽、形状和直径大小的变化上。由图3和图4 可知，随着贮藏时间的延长，对照组和处理组菇盖表面开始出现凹陷和泛黄，且直径也呈不断增大的趋势。在整个贮藏期间，处理组的菇盖色泽、形态在前9 d 与对照组均无明显差异，但在贮藏9 d后，经2.711 mg·m-3臭氧熏蒸处理15 min 的金针菇菇盖表面凹陷、泛黄程度，及菇盖增大、变薄现象明显得到缓解。在贮藏21 d 时，菇盖直径与同时期对照组（CKPE）相比降低了14%（P＜0.05）。说明臭氧熏蒸处理对于延缓金针菇感官品质具有良好的效果。

图2 臭氧熏蒸处理对金针菇感官评分的影响Fig. 2 Effects of ozone fumigation on sensory score of Flammulina velutipes

图3 臭氧熏蒸处理对金针菇菌盖感官的影响Fig. 3 Sensory effects of ozone fumigation on Flammulina velutipes cap

2.2.2 对金针菇失重率和呼吸强度的影响 从图5-A 可以看出，对照组和处理组的失重率均呈持续上升趋势。在整个贮藏期间，处理组的失重率始终低于对照组，在贮藏6 d 后，对照组和处理组的失重率有了明显的差异，对照组（CKPE）的失重率比处理组高21.65%（P＜0.05）。说明臭氧熏蒸处理对于降低金针 菇在贮藏期失重率有很好的效果。

从图5-B 可以看出，贮藏期间金针菇的呼吸强度无论是对照组还是处理组均呈先上升后下降然后又上升的变化趋势，与FANG 等[29]研究结果相似，具有呼吸跃型的特点。在贮藏前期（12 d），臭氧熏蒸处理组能有效地抑制金针菇子实体的呼吸强度（P＜0.05），其呼吸跃变高峰推迟至第12 天出现，但其呼吸峰值仍较高（50.51 mg·kg-1·h-1）。

图4 臭氧熏蒸处理对金针菇菌盖直径变化的影响Fig. 4 Effects of ozone fumigation on the diameter of Flammulina velutipes

图5 臭氧熏蒸对金针菇失重率（A）和呼吸强度Q（B）的影响Fig. 5 Effects of ozone fumigation on water mobility (A) and respiratory intensity Q (B) of Flammulina velutipes

2.2.3 对金针菇MDA 及相对电导率的影响 MDA 作为膜脂过氧化作用的最终产物，其含量可以反应食用菌菌体细胞遭受伤害的程度[30]。图6 结果显示，菇体MDA 含量在贮藏初期上升较为缓慢，而后迅速累积，变化趋势与相对电导率相似。说明膜脂过氧化与细胞膜的完整性破坏密切相关。对照组（CKPE）金针菇在贮藏第21 天时，MDA 含量达到3.51 μmol·g-1，而经2.711 mg·m-3臭氧熏蒸处理15 min 的金针菇MDA 含量仅为3.06 μmol·g-1，相比对照组降低了12.82%。表明臭氧熏蒸处理可以有效减少细胞膜脂过氧化，减轻细胞膜的损伤。

在贮藏第21 天时，对照组（CKPE）与处理组相对电导率分别为17.51%和15.48%，差异显著（P＜0.05）。食用菌子实体的衰老与细胞膜相对透性密切相关，衰老过程中产生大量活性氧自由基，这些自由基的累积直接或间接启动了膜脂过氧化作用，导致膜的损伤和破坏，膜透性增加，细胞内电解质大量外渗，电导率增大[31]。

图6 臭氧熏蒸对金针菇丙二醛（MDA）（A）、相对电导率（B）的影响Fig. 6 Effects of ozone fumigation on malondialdehyde (MDA) (A) and relative conductivity (B) of Flammulina velutipe

2.2.4 对金针菇褐变指数和菌落总数的影响 由图7 可知，贮藏期间金针菇的褐变指数呈上升趋势，但经臭氧熏蒸处理后，褐变指数上升趋势变缓，说明臭氧熏蒸可以延缓金针菇色泽的变化。

图7 臭氧熏蒸对金针菇褐变指数的影响Fig. 7 Effects of ozone fumigation on browning index of Flammulina velutipes

由图8 可知，菇体表面的菌落总数随着贮藏时间延长也呈不断上升趋势。经臭氧熏蒸处理菇体菌落总数显著低于对照组（CKPE）（P＜0.05），说明臭氧熏蒸处理对金针菇具有良好的防腐效果。

由图9-A、B 可知，贮藏期金针菇菇体内活性氧自由基含量都呈持续上升的变化趋势。在前9 d，及H2O2活性氧自由基含量在体内快速积累，加快了金针菇的体内代谢速度，随后开始缓慢升高。贮藏21 d 时，对照组（CKPE）生成速率为4.37 μmol·min-1·g-1FW，H2O2含量为27.27 μmol·g-1FW；而经臭氧熏蒸处理后，金针菇生成速率为4.17 μmol·min-1·g-1FW，H2O2含量为22.67 μmol·g-1FW，二者均显著低于对照组（P＜0.05）。同时，臭氧熏蒸还可以有效降低生成速率和推迟H2O2含量峰值出现时间。

图8 臭氧熏蒸对金针菇子实体菌落总数的影响Fig. 8 Effects of ozone fumigation on aerobic plate count of Flammulina velutipes

图9 臭氧熏蒸对金针菇超氧阴离子生成速率（A）和H2O2含量（B）的影响Fig. 9 Effects of ozone fumigation on superoxide anion formation rate (A) and hydrogen peroxide content (B) of Flammulin a velutipes

2.2.6 对金针菇体内SOD 和CAT 活性的影响 SOD属于诱导酶类，随着果蔬体内含量的积累，其活性逐渐增大[32]。由图10-A 可知，在贮藏期，金针菇SOD活性先上升后下降，和的变化趋势一致。在贮藏第9 天时，处理组和对照组的SOD 活性到达到最大值，对照组（CKPE）为48.16 U·h-1·g-1·FW，处理组为54.31 U·h-1·g-1·FW，处理组SOD 活性显著高于对照组（P＜0.05）。

CAT 是果实后熟衰老中的另一种保护性酶类，它可以清除H2O2，从而减少对膜的损伤，达到延缓细胞衰老的目的[32]。由图10-B 可知，金针菇在贮藏期的CAT 活性变化趋势与H2O2基本一致。在贮藏第12 天时，处理组和对照组的CAT 活性均到达到最大值，处理组CAT 活性为361.31 U·g-1·FW，显著高于对照组CKPE（P＜0.05)。之后，随着贮藏时间的延长，CAT活性缓慢下降。说明臭氧熏蒸处理可以减缓SOD、CAT 活性的降低，使其维持在较高水平，更好地清除氧自由基，从而减缓菇体衰老速度。

3 讨论

臭氧处理作为一种新型保鲜技术应用在果蔬采后保鲜已有大量的报道，且获得较好的保鲜效果。在蓝 莓、桑葚等采后贮藏研究中，发现臭氧处理可以减缓果实软化，减小失重率，抑制果实的呼吸强度，有效延缓果实衰老，还能防止细胞壁降解，诱导气孔缩小，抑制病菌侵入，减少水分蒸腾等[33-34]。近年来，臭氧技术也已开始应用到食用菌保鲜研究，例如，段颖等[35]采用臭氧处理对茶薪菇（Agrocybe aegerita）的保鲜研究结果表明，臭氧能够诱导气孔收缩，减少水分蒸腾，抑制茶薪菇呼吸作用，降低茶薪菇代谢水平，达到保鲜效果；杨艳芬等[36]也证实了臭氧能降低双孢蘑菇（Agaricus bisporus）新陈代谢，推迟呼吸高峰期和延缓自溶。而本研究重点从金针菇采后品质劣变规律以及活性氧（ROS）积累和相关抗氧化酶活性角度，考察臭氧熏蒸对金针菇贮藏期间抗氧化能力的影响。结果表明，臭氧熏蒸能有效地抑制金针菇呼吸强度，降低失重率，抑制MDA 含量的升高，降低ROS 的积累程度，使菇体内SOD 酶、CAT 酶活性保持在较高水平，明确了臭氧熏蒸对金针菇抗氧化能力的影响。

丙二醛水平高低是检测膜脂过氧化的重要指标[30]。KAN 等[37]研究表明在桃果肉细胞内的ROS 积累破坏了膜的结构和功能，引起膜脂过氧化，导致膜破裂，加速了细胞的衰老。食用菌的细胞膜主要由不饱和脂肪酸构成，在贮藏期间，极易受到ROS 自由基攻击而发生结构改变，细胞膜完整性遭到破坏，膜脂过氧化程度随之加剧，使酚类底物被进一步氧化，从而加速食用菌子实体的衰老[31]。本研究结果表明，臭氧熏蒸处理能有效抑制金针菇子实体内MDA 和ROS含量的积累。

图10 臭氧熏蒸对金针菇SOD 活性（A）、CAT 活性（B）的影响Fig. 10 Effects of ozone fumigation on SOD activity (A) and CAT activity (B) of Flammulina velutipes

抗氧化酶的活性是评价果蔬采后贮藏品质的重要指标[32]。GILL 等[38]研究表明SOD 通过催化生成O2和H2O2来去除，而CAT 将H2O2解离成H2O 和O2，这些过程都是ROS 在果蔬体内被SOD、CAT 去除必不可少的过程。本研究结果表明，金针菇贮藏过程中SOD、CAT 活性呈先上升后下降的趋势，这与JOLIVET 等[30]在果蔬保鲜上的研究结果一致，表明臭氧熏蒸处理能有效提高金针菇菇体内ROS 清除能力和抗氧化酶活性，从而延缓金针菇的衰老。

4 结论

金针菇子实体经2.711 mg·m-3臭氧熏蒸处理15 min，能有效抑制金针菇采后呼吸作用，较好地保持菇体水分；同时，臭氧熏蒸处理能够很好地抑制菇体内活性氧的积累，使超氧化物歧化酶酶、过氧化氢酶活性保持相对较高的水平，并通过抑制丙二醛的生成，避免了金针菇受到氧化伤害，起到一定的保鲜效果。在低温（4±1℃）贮藏18 d 后，感官品质良好，菇体保持光泽、菇盖较饱满、菌柄完好、色泽浅黄，仍具有较高的商品价值，可作为金针菇贮藏保鲜的一种有效方法。