烟草Hsc70-2 的克隆及对马铃薯Y 病毒侵染烟草的促进作用

龚明月，段啸天，余婷婷，王杰，申莉莉，李莹，刘明宏，李永亮，吕洪坤，章松柏，杨金广

（1 长江大学农学院，湖北荆州434025；2 中国农业科学院烟草研究所，山东青岛266101；3 贵州省烟草公司遵义市公司，贵州遵义563000；

4 云南省烟草公司保山市公司，云南保山678000；5 中国烟草总公司海南省公司海南雪茄研究所，海口571100）

0 引言

【研究意义】烟草马铃薯Y 病毒病又称“烟草脉坏死病”或“烟草脉带病”，是由马铃薯Y 病毒（Potato virus Y，PVY）侵染烟草引起的一种系统性侵染病害[1-2]。PVY 于1931 年由SMITH 首次发现[3]，属于马铃薯Y 病毒属（Potyvirus）成员，是危害烟草、马铃薯、番茄、辣椒等茄科作物的一种病毒。马铃薯Y 病毒属病毒为正链RNA 病毒，分布广泛，几乎在全世界都有发生，尤其在热带和亚热带地区更为流行，给农业生产带来巨大损失[4]。因此，研究PVY 的致病机制对于烟草马铃薯Y 病毒病的防治具有重要意义。【前人研究进展】正链RNA 病毒通过诱导宿主蛋白来促进其在受感染宿主中的高效复制。在模型RNA病毒——番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）致病机理的研究中发现，该病毒的复制酶复合物中含有热激蛋白70（heat shock protein 70，Hsp70），是TBSV 复制所必需的一种丰富的细胞质伴侣，这种胞质Hsp70 在TBSV 复制过程中发挥着多种作用，如影响病毒复制蛋白的亚细胞定位和膜插入，以及病毒复制酶的组装[5]。并且通过蛋白质组学分析证明，Hsp70 是TBSV 病毒复制复合体（virus replication complex，VRC）的一种组成成分[6]。热激蛋白（Hsp）是植物细胞内重要的分子伴侣，该蛋白在进化上高度保守，按照分子量大小的不同分为6个家族，即Hsp110s、Hsp90s、Hsp70s、Hsp60s、小分子sHsps 和泛素[7]，其中研究最多的是Hsp70家族。根据热激蛋白70 的表达类型，可分为组成型Hsc70 和诱导型Hsp70，前者在正常条件下就有本底表达，以维持细胞正常生命活动的需要[8-9]；而后者在受环境因素胁迫时诱导表达，以应付外界恶劣环境条件的威胁[10]；Hsc70 广泛分布于原核及真核生物细胞中，是维持生命活动的重要功能蛋白，具有多项生物学功能：协助新生蛋白的折叠，参与细胞内蛋白质的转运，参与免疫复合物的形成和分解及降解冗余蛋白[11-12]。【本研究切入点】Hsp70 蛋白家族在多种病毒和寄主互作中的作用已有大量研究报道，而Hsc70 对植物病毒尤其是对PVY 侵染复制的影响并不明确。前期研究发现本氏烟（Nicotiana benthamiana）在PVY 侵染后NbHsc70-2mRNA 水平显著上升，推测NbHsc70-2可能参与PVY 的侵染过程。【拟解决的关键问题】以本氏烟为材料，通过开展生物信息学分析、亚细胞定位、组织特异性表达和基因功能验证等研究，探索NbHsc70-2 在PVY 侵染复制中的作用，为烟草抗马铃薯Y 病毒病研究提供理论依据。

1 材料与方法

试验于2018—2019 年在中国农业科学院烟草研究所植物保护研究中心进行。

1.1 植物材料与病毒

供试植物材料为本氏烟，本氏烟种子点播于混合土中（土壤﹕草炭= 1﹕1），于25℃人工气候室中培养，光周期为14 h 光照/10 h 黑暗，相对湿度为70%，试验采用5—6 叶期烟苗。

PVY 毒源为中国农业科学院烟草研究所保存的N株系。取1 g PVY 野生型毒源植株的叶片，放入提前灭菌消毒的研钵中，加入40 mL PBS 缓冲液，研磨成浆并用纱布过滤除去叶片残渣获得悬浮液以备用；浸润PVY 病毒汁液于本氏烟烟苗（4 周）的第3—4 片真叶，每片叶200 µL。

PVY-GFP 属于PVY 坏死株系（PVYN）的侵染性克隆，是通过无义突变在PVY 侵染性克隆的P1与HC-pro间插入一个SacⅡ限制性内切酶酶切位点，并在该酶切位点中插入表达了外源绿色荧光蛋白（GFP）的重组病毒，该病毒能系统侵染本氏烟，病毒扩增至植株非接种部位而呈现荧光[13]。

1.2 NbHsc70-2 的克隆与分析

本氏烟RNA 提取按照TaKaRa RNAiso Plus（Total RNA 提取试剂）试剂盒手册进行，并反转录为cDNA（Vazyme），根据拟南芥中已报道的Hsc70 核苷酸序列在美国本氏烟草数据库（https://solgenomics.net/ organism/nicotiana_benthamiana/genome）中比对得到一个描述为Heat shock 70 kD protein 基因（基因号：Niben101Scf00449g06008.1），根据该基因序列设计特异性引物NbHsc70-2 F/R（表1），以本氏烟cDNA 为模板PCR 扩增NbHsc70-2；PCR 产物连接pEasy-Blunt Simple 载体并转化E. coil感受态菌株（TaKaRa），阳性克隆委托派森诺生物科技有限公司测序；利用MEGA 6.0[14]进行核苷酸多序列比对分析后，基于最低的贝叶斯标准（Bayesian information criterion，BIC）确定最适合核苷酸替代模型为木村双参数模型（Kimura two-parameter model，K2P），应用于最大似然法（maximum-likelihood，ML）构建系统发育树。各分支的置信度通过1 000次自举抽样（bootstrapping）进行评估。

1.3 NbHsc70-2 蛋白的亚细胞定位

利用BaCelLo[15]和SignalP 4.0[16]进行NbHsc70-2的亚细胞定位和信号肽预测；根据NbHsc70-2序列设计不含有终止密码子的带XbaI/KpnI 酶切位点的特异性引物NbHsc70-2-XbaI F/KpnI R（表1），并以本氏烟 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，利用In-Fusion 技术（TaKaRa）将产物与Fu46 载体相连，构建NbHsc70-2::RFP 融合基因，再利用LR 同源重组技术（Invitrogen）将融合基因连接到pEarleyGate100载体，最终得到pEarleyGate100::NbHsc70-2::RFP 载体；将含有pEarleyGate100::NbHsc70-2::RFP 载体和pEarleyGate100::RFP 载体的 LBA4404 农杆菌（OD600=0.8）浸润本氏烟下表皮，培养于25℃人工气候室中，光周期为14 h 光照/10 h 黑暗，相对湿度为70%，72 h 后制片置于激光共聚焦显微镜（SP8，Leica）下观察明、暗视野下的表达情况。

表1 试验中采用的引物及序列Table 1 Sequence of the primers used in this study

1.4 NbHsc70-2 沉默载体的构建

根据NbHsc70-2基因序列，用Premier 5.0 设计一对含有限制性核酸内切酶EcoRI、KpnI 的特异性引物RNAi NbHsc70-2 F/R（表1），PCR 扩增大小为350 bp目的沉默片段，利用In-Fusion 技术（TaKaRa）将产物与pTRV2 载体相连，构建pTRV::NbHsc70-2 重组载体；将含有pTRV::NbHsc70-2 载体、pTRV::PDS 及pTRV00 空载体的LBA4404 农杆菌（OD600=0.8）注射本氏烟下表皮，7 d 后检测沉默效率，进行后续试验。

1.5 NbHsc70-2 瞬时过表达载体的构建

根据NbHsc70-2基因序列设计含有AhdI酶切位点的特异性引物NbHsc70-2-AhdI F/R（表1），并以本氏烟cDNA 为模板进行PCR 扩增，利用In-Fusion 技术（TaKaRa）将产物与 GWC 载体相连，构建GWC::NbHsc70-2 入门载体，再利用LR 同源重组原理（Invitrogen）将入门载体连接到pEarleyGate100载体，最终得到pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2表达载体；提前24 h 给本氏烟浸润PVY 病汁液，将含有pEarleyGate100::GWC::NbHsc70-2 表达载体和pEarleyGate100::GWC 载体的LBA4404 农杆菌（OD600=0.8）浸润本氏烟下表皮，48 h 后开始采样检测PVYCP基因积累量。

1.6 qRT-PCR 与统计分析

根据不同样品中特定基因的基因序列设计各基因 的荧光定量检测引物（表1），同时设置Actin作为内参。分别提取各取样时间点的处理组及对照组材料的总RNA（TaKaRa），反转录成cDNA（Vazyme）。以cDNA 为模板，按照ChamQTMUniversal SYBR® qPCR Master Mix（Vazyme）试剂盒说明书进行操作，在Applied Biosystems 7500 real-time PCR 机型上进行扩增。反应体系：10 µL 2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，0.4 µL Primer1（10 µmol·L-1），0.4 µL Primer2（10 µmol·L-1），2 µL cDNA，补蒸馏水至总体积20 µL。反应程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s；60℃ 30 s；40 循环；95℃ 15 s；60℃ 1 min，95℃ 15 s。相对表达量采用2-ΔΔCt法计算[17-18]，使用7500 Software v2.3 进行数据统计分析并使用GraphPad Prism6.0 绘图。P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 NbHsc70-2 克隆与序列分析

根据拟南芥中已报道的Hsc70 核苷酸序列在美国本氏烟草数据库中比对得到一个描述为Heat shock 70 kD protein 基因（基因号：Niben101Scf00449g06008.1）。为鉴定Niben101Scf00449g06008.1 基因，在NCBI（美国国立生物技术信息中心数据库）中比对发现Niben101Scf00449g06008.1 与NaHsc70-2、NsHsc70-2、NtHsc70-2序列相似性最高，分别有69.07%、69.07%、68.25%核苷酸相似性，但NaHsc70-2、NsHsc70-2、NtHsc70-2的编码序列（coding sequence，CDS）均有1 953 bp，而Niben101Scf00449g06008.1 基因的CDS 序列中只有1 443 bp，因此推测Niben101Scf00449g06008.1 基因CDS 序列部分缺失，通过比对NCBI 上已发表的Hsc70序列发现该基因非常保守，设计特异性引物，通过PCR扩增得到Niben101Scf00449g06008.1 基因的完整CDS 序列；将该CDS 序列与NaHsc70-2、NsHsc70-2、NtHsc70-2序列进行比对，发现分别具有94.49%、94.49%、93.78%核苷酸相似性，对应的蛋白质间分别具有97.38%、97.38%、97.23%氨基酸相似性。通过获取与Niben101Scf00449g06008.1 相似度高于96%的基因CDS 序列，并用Clustal W 进行核酸序列比对，利用ML 算法构建系统发育树，结果均表明Niben101Scf00449g06008.1 与NaHsc70-2关系最近（图1），暗示Niben101Scf00449g06008.1 可能是Hsc70-2在本氏烟中的同源基因。从图2 中可以看出，Niben101Scf00449g06008.1 与NaHsc70-2 蛋白氨基酸序列相似性最高，表明Niben101Scf00449g06008.1 是Hsc70-2在本氏烟中的同源基因，命名为NbHsc70-2。

图1 NbHsc70-2 及其同源基因系统发育分析（ML 算法）Fig. 1 Phylogenetic analyses of NbHsc70-2 and its homologues (ML algorithm)

2.2 NbHsc70-2 组织表达特异性

以Actin作为内参基因，利用qRT-PCR 分别检测NbHsc70-2在本氏烟根、茎、叶中的表达情况。结果显示NbHsc70-2在叶中的相对表达量较高，在根和茎中的表达量很低，其中叶片相对表达量是根中的1.91倍（图3）。因此，后期试验均采集叶片样品进行研究。

2.3 PVY 侵染对NbHsc70-2 的影响

采用qRT-PCR 检测PVY 侵染1、3 d 后NbHsc70-2mRNA 水平的变化，结果显示PVY 侵染后NbHsc70-2mRNA 水平明显上升，与对照相比，处理组1 d 无明显差异，PVY 处理3 d 后NbHsc70-2mRNA 水平上调，处理组是对照组的9.24 倍（图4），表明PVY 侵染会引起NbHsc70-2mRNA 水平上调，暗示NbHsc70-2可能在PVY 侵染过程中发挥重要作用。

利用BaCelLo 预测NbHsc70-2 蛋白的亚细胞定位，发现NbHsc70-2 蛋白定位于细胞质上的可能性高于其他部位。SignalP4.0 Server 信号肽预测结果显示该蛋白无信号肽，即NbHsc70-2 蛋白不属于分泌蛋白。为验证亚细胞定位的预测，将NbHsc70-2 蛋白与红色 荧光蛋白RFP 构建融合表达载体，注射本氏烟表皮瞬时表达进行亚细胞定位，激光共聚焦显微镜显示融合蛋白与Cytoplasm-FDA（细胞质Marker）定位重合，表明NbHsc70-2 蛋白定位在细胞质中（图5）。

图2 NbHsc70-2、NaHsc70-2、NtHsc70-2 及NsHsc70-2 蛋白氨基酸序列比对分析Fig. 2 Amino acid sequences multiple alignment among NbHsc70-2, NaHsc70-2, NtHsc70-2 and NsHsc70-2

图3 NbHsc70-2 的组织表达特异性分析Fig. 3 Analysis of tissue expression specificity of NbHsc70-2

图4 PVY 侵染本氏烟后NbHsc70-2 水平的变化Fig. 4 Gene accumulation of NbHsc70-2 after PVY infection in N. benthamiana

利用PVY-GFP 融合表达载体与NbHsc70-2-RFP融合表达载体共浸润本氏烟叶片 48 h 后，观察PVY-GFP 侵染对NbHsc70-2 蛋白定位的影响。结果显示，PVY-GFP 侵染后，NbHsc70-2-RFP 融合蛋白的细胞质定位发生变化，部分转移至细胞核中，NbHsc70-2-RFP 融合蛋白与PVY-GFP 共定位在细胞质及细胞核中，推测NbHsc70-2 可能是PVY 病毒复制复合体的一种组成成分，参与胞内移动过程。

2.4 沉默NbHsc70-2 对PVY 积累量的影响

为了进一步研究NbHsc70-2编码的Hsc70-2 蛋白在PVY 侵染本氏烟中的功能，利用病毒诱导基因沉默技术构建VIGS 沉默体系下调本氏烟中NbHsc70-2的含量，分析寄主中NbHsc70-2的含量降低后对PVY侵染本氏烟的影响。由于NbHsc70-2具有高度的CDS核酸相似性，因此选择NbHsc70-2相对不保守区设计沉默靶标。同时，根据不保守区设计qRT-PCR 引物以扩增NbHsc70-2，用于检测基因沉默效率（表1）。含NbHsc70-2沉默重组质粒农杆菌浸润本氏烟7 d 后，对NbHsc70-2沉默效率为（67.50±0.29）%（图6-B）。从图6-A 可以看出沉默NbHsc70-2导致心叶皱缩及植株矮化，暗示NbHsc70-2编码的NbHsc70-2 蛋白可能参与调节植株生长发育。

含不同重组质粒农杆菌浸润寄主植株7 d 后，将PVY-GFP 接种于TRV 浸润叶的上面第3 片叶，接种7 d 后，在手提式紫外灯下观察本氏烟中的绿色荧光情况；在TRV 对照组中PVY-GFP 系统侵染使得非接种叶片呈现荧光现象，而NbHsc70-2沉默组中无明显绿色荧光出现（图6-C），荧光点数约是对照组的28%（图6-D）。表明本氏烟中NbHsc70-2的mRNA 含量降低，可导致PVY-GFP 系统性侵染受到抑制。

为了进一步明确下调NbHsc70-2表达后抑制PVY侵染本氏烟，浸润接种pTRV::NbHsc70-2 后7 d 接种野生型病毒PVYN，从RNA 水平检测病毒的相对累积量。从图7-A 可以看出沉默组与对照组的PVYCP表达量都呈现上升趋势，但沉默组的上升趋势较对照组慢；在沉默组上接种PVY 后 1 d，CP表达量较对照组已有下降；3 d 沉默组中的表达量是对照组的14%；5 d 沉默组中的表达量是对照组的0.004%。表明沉默NbHsc70-2后，显著延缓植株内PVYCP的mRNA 积累。

图6 沉默NbHsc70-2 表型分析Fig. 6 Phenotype analysis of NbHsc70-2 silencing

图7 沉默及过表达NbHsc70-2 对PVY 积累的影响Fig. 7 Effects of NbHsc70-2 silencing and overexpression on PVY accumulation

2.5 过表达NbHsc70-2 对PVY 积累量的影响

为了进一步确定NbHsc70-2编码的Hsc70-2 蛋白在PVY 侵染寄主过程中的作用，通过LR 反应将构建好的pGWC-NbHsc70-2 与pEarleyGate100 重组，构建NbHsc70-2 瞬时表达载体，以表达载体pEarleyGate100在本氏烟中过量表达NbHsc70-2，提高寄主中NbHsc70-2含量，分析PVY 侵染植株后RNA 水平上的病毒累积量。

从图7-B 可以看出经过表达载体处理48 h 后，过表达组的PVYCP表达量较对照组已有上升，过表达组中的表达量是对照组的2.31 倍；处理72 h 后过表达组中的PVYCP表达量是对照组的2.56 倍。表明过表达寄主中NbHsc70-2的含量能显著增加植株内PVYCP的积累。

3 讨论

植物热激蛋白70 是热激蛋白家族中保守、普遍表达的，家族中通常具有两个主要功能区：N 端核酸结合区（nucleotide binding domain，NBD）和C 端底物结合区（substrate binding domain，SBD）。N 末端核酸结合区具有结合并水解ATP 的活性中心，它与ATP的结合-水解过程调控其对多肽的亲和力[19]。C 端存在高度保守基序结构（motif），通常用于指示亚细胞定位信号或与其他伴侣或共同伴侣相互作用[20-21]。例如定位于叶绿体中的Hsp70 其motif 结构的氨基酸序列为 PECDVLDADFTDSK，定位于线粒体中的为PEAEYEEAKK，定位于内质网中的为HDEL，而定位于细胞质中的为EEVD[22]。本试验中，在美国本氏烟草数据库中筛选到的Niben101Scf00449g06008.1 基因经鉴定为NbHsc70-2，编码649 个氨基酸，与已报道的NaHsc70-2 蛋白的相似性达到97.38%，系统进化树也显示NbHsc70-2与NaHsc70-2基因亲缘性最高，并且该蛋白C 端存在EEVD 基序，亚细胞定位结果显示该蛋白也定位于细胞质中，这说明NbHsc70-2是Hsc70-2在本氏烟中的同源基因。

Hsc70 蛋白是一种结构型Hsp70，在所有的细胞内均可表达，是一种ATP 结合蛋白[23]，其在非生物胁迫下无明显表达差异，如热刺激后表达量不增加或减少增加；在生物胁迫中，如在病毒的侵染过程中，Hsc70 被认为影响病毒蛋白的复制、积累、运动和折叠。许多病毒将Hsc70 招募到膜复制工厂，如红花苜蓿坏死花叶病毒（Red clover necrotic mosaic virus，RCNMV）[24]、芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）[25]和中国小麦花叶病毒（Chinese wheat mosaic virus，CWMV）[26]。WANG 等[27]研究表明，宿主Hsc70是乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）复制的辅助因子，Hsc70 的表达水平与HBV 的复制呈正相关性；MATHIOUDAKIS 等[28]研究表明，Hsc70-3 mRNA水平及蛋白水平在番茄花叶病毒（Pepino mosaic virus，PepMV）侵染过程中被诱导增加；有研究表明，Hsp70 家族与VRC 相关，能增强病毒RNA 的复制；例如Hsp70 在番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）侵染复制中是TBSV VRC 的一种组成成分[5-6]；在TuMV 中Hsc70-3 是膜结合复制复合体的一部分[25]。此外Hsc70 还与病毒基因组成分相互作用，以增强病毒在宿主植株中的RNA 积累；Hsp72在丙肝病毒（Hepatitis C virus，HCV）复制中与复制蛋白NS5A、NS5B（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）互作[29]。Hsc70-3 在PepMV 复制中与PepMV CP 相互作用；并且Hsc70 还参与病毒细胞间转运，在苘麻花叶病毒（Abutilonmosaic virus，AbMV）中运动蛋白（movement protein，MP）与Hsc70 相互作用[30]，表明Hsc70 可能在病毒转运方面具有一定的功能；在PepMV 中Hsc70-3 与PepMV CP 相互作用复合物出现在细胞质和细胞核中，表明Hsc70-3 参与PepMV 的细胞内移动[28]；ALAM 等[31]研究表明，Hsc70-2 与纯化的黄瓜坏死病毒（Cucumber necrosis virus，CNV）病毒粒子结合，并在病毒颗粒的解体中发挥作用。

本研究发现PVY 侵染的本氏烟中NbHsc70-2mRNA 水平上升，且引起部分NbHsc70-2 蛋白定位转移至细胞核中，NbHsc70-2 蛋白与PVY 共定位在细胞质及细胞核中；在AbMV 中MP 与Hsc70 相互作用，在PepMV 中也发现Hsc70-3 参与PepMV 的胞内移动；推测NbHsc70-2 可能参与PVY 的胞内移动过程。本研究利用VIGS 技术下调宿主中NbHsc70-2含量，进一步发现该基因缺失后，能够显著抑制PVYCP的积累量，表明NbHsc70-2的表达水平与PVY 的复制呈正相关，沉默组与对照组相比下降幅度较大可能是由于NbHsc70-2 是PVY 侵染复制所需要的重要组成部分，NbHsc70-2 是PVY VRC 的一部分，PVY 侵染需要招募宿主NbHsc70-2 蛋白到膜复制工厂形成PVY病毒复制复合体，缺失NbHsc70-2 导致PVY 无法形成VRC 进而导致沉默组与对照组的差异较大；并且病毒的复制是快速增长的，这也是导致沉默组与对照组差异较大的原因；同时沉默NbHsc70-2后7 d 植株出现皱缩及矮化症状，这也暗示了NbHsc70-2 在植物生长发育中具有重要的作用。但NbHsc70-2 功能的丧失可能造成了植株的一些生理缺陷，因此本研究进一步上调宿主中NbHsc70-2的含量，结果表明过表达NbHsc70-2能够提高PVYCP的积累量，这与WANG等[27]的研究结果一致。

4 结论

NbHsc70-2 为Hsp70 家族蛋白，PVY 侵染后导致其基因表达上升。NbHsc70-2是响应PVY 侵染的重要基因，正向调控PVY 病毒的复制，抑制该基因的表达可以提高植株对PVY 的抗性，该基因在烟草抗马铃薯Y 病毒病方面具有较大的应用价值，未来可将该蛋白作为一个抗病毒药剂靶标。