结核病免疫学实验室检测技术新进展

罗风，李晓非

(昆明市第三人民医院检验科，昆明 650041)

结核病是一个全球性的公共健康问题，2017年全球共有640万新发结核病例。成功诊断及治疗每年可使上百万结核病患者避免死亡，最新数据显示，据估计2000—2017年共避免5 400万人死亡。但是目前结核病检出持续存在很多漏检[1]。血清学分析检测结核分枝杆菌特异性抗原(tuberculosis-specific antigen，TBAg)，具有简单、成本低、操作方便和测定快速等优点，被认为是筛查结核病例的有力方法，特别是在中国、印度等资源有限的国家[2-3]。在结核病诊断血清学研究领域，国内外学者一直致力于寻找在结核病患者中能引起强烈抗体反应的潜在血清诊断抗原，新的结核病免疫学实验室检测技术不断出现。本文着重介绍近几年国内外关于结核病免疫学实验室检测方面的新技术新进展，以及新技术的检测原理及优缺点，以期促进优良实用的结核病诊断新技术在我国各级医疗机构普及推广。

1 细胞免疫检测技术

1.1体外试验

1.1.1结核感染T细胞斑点试验新用法 结核感染T细胞斑点试验(T-cell spot of Tuberculosis，T-SPOT.TB)基本检测原理是利用当机体T淋巴细胞再次受到具有毒力的TBAg刺激后，活化为分泌结核分枝杆菌特异性γ干扰素的效应T细胞，检测并计数效应T细胞数量，以判断机体是否被结核分枝杆菌感染。试验所使用的TBAg是致病结核分枝杆菌RD1区上Rv3874编码的培养滤液蛋白10(culture filtrate protein-10，CFP-10)和Rv3875编码的早期分泌靶向抗原6(early secreting antigen target-6，ESAT-6)[4-5]。王婷等[6]利用T-SPOT.TB试验对378例结核分枝杆菌培养阳性患者和824例体检健康者进行检测，得出T-SPOT.TB结果阳性诊断活动性结核的敏感性为91.0%(344/378)，特异性为75.2%(620/824)；同时该团队对T-SPOT.TB结果进行深度分析，发现TBAg/植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)斑点数的比值在区分活动性结核和潜伏性结核感染时，效果优于T-SPOT.TB斑点计数判定阴阳性的结果，ROC曲线下面积分别为0.881和0.7～0.8，同时认为该比值在诊断肺外结核时也具有一定参考价值。Feng等[7]在同济医院招募1 871例研究对象(包括734例确诊肺外结核患者、1 137例临床易与肺外结核混淆的非肺外结核患者)，分析T-SPOT.TB试验结果中TBAg/PHA比值对肺外结核的诊断及疗效监测的性能，结果证明T-SPOT.TB结果阳性患者中，直接T-SPOT.TB结果对区分肺外结核和疑似肺外结核的非肺外结核患者的诊断价值有限，TBAg/PHA比值可能是辅助诊断肺外结核的有用工具；PHA斑点数值反映了机体的免疫状态，有助于判断不同免疫状态下肺外结核患者T-SPOT.TB结果的可信度；TBAg/PHA可用于免疫抑制患者结核病的辅助诊断，也可能是临床监测肺外结核抗痨治疗效果的有用指标。总之，T-SPOT.TB试验在结核病诊断方面有较高的作用已得到广泛验证[8-9]，且该试验全球范围内亦得到广泛应用。最新研究对该试验结果各指标进行深度分析后发现，该试验不仅能对结核病进行诊断，还能有效区分活动性结核与潜伏性结核感染以及对抗痨疗效进行监测等[7,10-11]。因此，对该经典试验方法不断改良以及对其试验结果进行深度解读，将使其在临床结核病诊治方面发挥更大的作用。

1.1.2T-SPOT.TB相关改进技术 新型T细胞检测方法(ELISPOT-IL-2技术)基本原理是在T-SPOT.TB试验的基础上，以原核表达结核分枝杆菌标准菌株PPE36-p27蛋白[12-14](其控制基因属于结核分枝杆菌RD1区域高度保守序列，为PPE36基因Rv2108，属于PPE蛋白家族)为刺激原，刺激机体产生细胞因子IL-2，通过与固相载体上包被的抗人IL-2单克隆抗体和后加入的生物素标记IL-2单克隆抗体分别结合后，最后加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的链霉亲合素，形成固相抗人IL-2单克隆抗体-待测抗原-生物素标记IL-2单克隆抗体-HRP标记的链霉亲合素复合物，洗涤去除杂质，显色(以四甲基联苯胺为底物)终止反应，在显微镜下观察形成的斑点。2018年Della等[15]报道可采用LIOSpot®TB试剂盒来区分成人患者中潜在结核病感染和活动性结核病，同时证明TBAg Ala-DH能刺激活动性肺结核患者机体产生大量IL-2，而结核潜伏感染患者产生的该细胞因子量极低，因此该抗原被认为是区分结核潜伏感染和活性肺结核的有用工具。该方法在T-SPOT.TB试验基础上进行改进，用TBAg Ala-DH诱导机体分泌细胞因子IL-2，然后采用酶联免疫斑点试验检测斑点数，来诊断并区分潜在结核病感染和活动性结核病。LIOSpot®TB试剂可以在成人患者中区分结核潜伏感染和活动性结核病，但该报道对该试验区分儿童潜在结核病感染和活动性结核病的性能，接种卡介苗对该试验的影响等方面尚未得出明确结论。T-SPOT.TB的多种改进技术在后期将会进一步优化，以应用于结核病诊疗，以上新方法尚未进行大量临床验证，临床应用价值尚在探索阶段[16]。

1.2体内试验：重组蛋白(ESAT-6和CFP-10融合蛋白)皮试试验 重组蛋白(ESAT-6和CFP-10融合蛋白)皮试试验是在结核菌素皮肤试验(tuberculin skin test，TST)的基础上发展起来的。由于TST的结核菌素(包括致病、非致病分枝杆菌及卡介苗)成分中含有多种分枝杆菌共同抗原，而卡介苗接种普及，导致TST特异性很差，不能真正反映机体结核分枝杆菌感染状态，临床应用价值有限[17]。重组蛋白(ESAT-6和CFP-10融合蛋白)皮试试验采用致病结核分枝杆菌基因RD1区上Rv3874编码的CFP-10抗原和Rv3875编码的ESAT-6抗原，该TBAg在大多数环境分枝杆菌及所有卡介苗菌株上不存在，此突破性技术进展提高了试验的正确性[18]。2018年俄罗斯Slogotskaya团队[19]对结核重组变应原(含ESAT6-CFP10蛋白)皮肤试验(Diaskintest)展开研究，收集2013—2016年在莫斯科市基层医疗机构新诊断活动性肺结核儿童和青少年共441例(其中162例已接种卡介苗)，所有受试者均进行Diaskintest和TST试验，最终完成Diaskintest试验421例，完成TST试验414例，结果发现当硬结直径临界值为5 mm时，Diaskintest和TST试验的检测敏感性分别为97.9%(412/421)、98.1%(406/414)，而当硬结直径临界值为15 mm时，两者的检测敏感性分别为61.1%(257/412)、46.1%(191/414)，由此得出结论：当硬结直径临界值为15 mm时，Diaskintest试验检测患有活动性肺结核的儿童和青少年的敏感性显著高于TST试验，且前者在大规模卡介苗接种条件下具有很高特异性。丹麦哥本哈根Ruhwald博士及其团队[20]报道了关于基于ESAT-6和CFP-10抗原的一种新的特异性皮肤试验(C-Tb)诊断结核分枝杆菌感染的安全性和有效性研究，该研究自2012年7月24日至2014年10月2日，共招募979名受试者，对受试者行γ干扰素释放试验、TST试验和C-Tb试验，结果发现随着被结核分枝杆菌感染风险的增加，C-Tb检测呈强阳性趋势，同时发现C-Tb的安全性与TST相似，结论为由于其不受卡介苗接种状态的影响，C-Tb皮肤试验可在TST常用的环境中提供更准确的治疗指导依据。目前，我国关于重组融合ESAT6-CFP10免疫原作为皮肤试验试剂用于结核病诊断的Ⅰ、Ⅱa期临床试验结束，相关数据已公布，单剂量1、5、10或20 μg/mL重组ESAT6-CFP10作为结核分枝杆菌感染诊断的皮肤试验试剂在中国耐受性好且安全[21-22]，该皮肤试验似乎是一种安全有效的结核病诊断方法，将进一步验证其在鉴别结核病方面的有效性。综上，重组蛋白(ESAT-6和CFP-10融合蛋白)皮试试验具有以下优点：对结核病诊断具有很高的特异性、敏感性，其诊断准确度与酶联免疫斑点试验相当，却克服了其实验材料成本高、需配备实验室、操作繁琐等弊端，因此非常适用于资源有限地区医疗机构大规模筛查结核病；该试验无卡介苗及其他非致病性分枝杆菌产生的交叉反应，在大规模卡介苗接种条件下具有很高的特异性，可在TST常用的地区为临床提供更准确的诊疗指导依据；重组ESAT6-CFP10免疫原在我国具有良好的耐受性和安全性，目前未有严重不良事件的报道；且在制备过程中，重组融合蛋白ESAT6-CFP10相比其他形式的蛋白质更稳定、有效，因此其被认为是诊断结核分枝杆菌感染的最佳皮肤试验试剂。目前，该试验也存在诸多不足：比如在相关研究中，纳入人群未包含HIV感染者和其他低免疫力人群，也缺乏一定数量的临床易与结核病混淆的非结核病患者，因此ESAT6-CFP10的敏感性和特异性可能被高估；同时，以上研究尚未对不同人群进行大样本检测，以确定该试验在不同人群中诊断结核病的最佳阈值；且该试验区分活动性结核与结核潜伏感染的性能尚不明确，关于其临床应用价值还需要进一步深入探索研究。

2 体液免疫检测技术

2.1TBAg检测技术

2.1.1免疫荧光双标法联合激光扫描共聚焦显微镜技术(laser scanning confocal microscopy，LSCM) 免疫荧光双标法联合LSCM技术检测脑脊液单核细胞ESAT-6，ESAT-6检测采用免疫荧光双标法，用LSCM在光源为波长405 nm和635 nm激光器激发的双重荧光标记下，观察经抗荧光猝灭封片液封片的脑脊液细胞玻片单核细胞着色三维成像情况，结果判定：细胞胞核呈蓝色荧光、胞质呈红色荧光，为阳性；细胞胞核呈蓝色荧光、胞质不着色，为阴性。李美杰等[23]将该方法应用于结核性脑膜炎的早期诊断研究，选取35例确诊结核性脑膜炎患者为病例组，35例其他神经系统疾病患者为对照组，结果发现两组间差异有统计学意义(P=0.000)，其诊断结核性脑膜炎的特异性和敏感性分别为97.14%、80.00%，该抗原检测方法能为早期结核性脑膜炎的诊断提供一定依据。该方法优点：(1)检测致病菌存在的直接证据TBAg，特异性高；(2)避免间接检测抗原或抗体时由于患者机体免疫功能低下导致的假阴性结果；(3)LSCM技术在荧光成像基础上增添激光扫描设置，进一步采用计算机进行图像集中处理分析，具有高分辨性、多重荧光同时观察和三维重建等优势，与免疫荧光双标法配合，充分发挥出LSCM的优势，是观察细胞立体结构的有效工具；(4)该试验可为结核性脑膜炎临床早期诊断提供一定依据。缺点：(1)随着患者治疗时间的延长及病情的好转，检测结果可能出现假阴性；(2)无法区分机体为活动性或潜伏性结核分枝杆菌感染状态；(3)该试验的相关研究招募样本量有限，未对多种不同类型结核病的诊断性能进行研究，结果具有一定的局限性。

2.1.2磁珠耦合金纳米粒子免疫PCR法(magnetic beads-gold nanoparticles-immuno-PCR，MB-GNP-I-PCR) MB-GNP-I-PCR法[24]检测纯化的结核分枝杆菌ESAT-6抗原的基本原理是纳米技术结合I-PCR技术，其中I-PCR是一种超灵敏的方法，结合了ELISA的多功能性和PCR的指数扩增能力[25-26]。该方法的优点：(1)该技术具备纳米生物技术信号放大的作用和I-PCR技术中ELISA的简单性和多功能性，以及PCR的指数放大能力和敏感性，可以检测出更多的结核病患者(如涂片阴性肺结核)，是一种超灵敏的检测方法，提高了生物标记物的检出限(MB-GNP-I-PCR技术检测纯化的ESAT-6的检出限为10 fg/mL，是同类ELISA的1×105倍)；(2)该技术开创性地提出采用基于纳米颗粒的I-PCR技术检测TBAg；(3)该方法试验试剂制备相对简单、试验时间相对较短、基质效应不明显，在结核病的临床诊断方面有广阔的应用前景。不足之处：该方法尚未进行大量临床验证，其临床应用价值尚需进一步深入研究。

2.1.3基于石墨烯/聚苯胺修饰丝网印刷电极的多层电化学免疫传感器 马来西亚学者报道了基于石墨烯/聚苯胺修饰丝网印刷电极的多层电化学免疫传感器检测TBAg CFP-10在结核病早期诊断中的应用[27]。该新检测平台在临床结核病早期诊断中具有潜在的应用价值，检测原理是基于以石墨烯/聚苯胺(graphene/polyaniline，GP/PANI)为纳米复合材料，在丝网印刷金电极(screen-printed gold electrode，SPGE)上制备一种能快速灵敏检测相对分子量为10 000的结核生物标志物CFP-10的夹心式电化学免疫传感器，用傅立叶变换红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)和场发射扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscopy，FESEM)对制备的GP/PANI纳米复合材料进行表征，分别用拉曼光谱和FESEM结合能谱仪研究GP/PANI改性SPGE的化学键和形态，从研究中可以清楚地看出，通过滴注技术成功地将GP/PANI涂层到SPGE上，然后用循环伏安法研究改性电极的电化学性能，GP/PANI改性SPGE的有效表面积比裸SPGE提高了5倍左右，最后用差示脉冲伏安法检测CFP-10抗原。该检测平台具有操作简单、灵敏度高、标本用量少、快速、一次性使用等特点，能在3 h内检测到标本中的CFP-10，线性范围为20～100 g/mL(r2=0.99)，估计检出限为15 ng/mL；并且检测成本低，是一种经济的结核病诊断试验替代策略。该新方法尚未进行大样本临床验证，临床应用价值尚在探索阶段。

2.1.4等离子体酶联免疫吸附试验 等离子体酶联免疫吸附试验平台是一种超灵敏肉眼可直接判断结果的早期结核病诊断方法，这项技术利用在过氧化氢存在下过氧化氢酶的生物催化作用，具有不同形态和光学性质的金纳米粒子(GNPs)分别在无靶点或有靶点的情况下产生红色或蓝色溶液，将纳米粒子形成有色溶液与是否存在结核分枝杆菌特异性分析物(该检测平台目前主要检测结核病早期特异性候选生物标记物CFP-10)联系起来，以快速对结核病进行诊断[28]。该技术采用一种新的信号产生机制，通过肉眼和光谱分析检测患者痰中CFP-10，克服了传统ELISA检测在靶标分子浓度偏低时易出现偏差的问题，可将痰标本中CFP-10检出限降低至0.01 μg/mL，且超敏、便携、成本低、操作简单、可通过肉眼读取结果，不需要任何昂贵的仪器或专业技术人员，特别适用于在资源匮乏国家和地区进行结核病的早期诊断。其性能稳定，检测结果不受痰标本中复杂基质的干扰，可直接检测出样本中是否存在待测物。目前该新方法尚未进行大样本临床验证，临床应用价值尚在探索阶段。

2.2多种免疫分子检测技术：蛋白质芯片技术 蛋白质芯片技术原理是将不同目标蛋白质按预先设置的排列顺序有序地固定于各种载体(载玻片、滤膜或滴定板等)表面做成微阵列检测芯片，根据抗原抗体高度特异性结合的特点，用标记了特定荧光物质的针对芯片上蛋白质的TBAg或抗体与检测芯片反应，进一步洗涤去除未与芯片上蛋白质特异性结合的荧光抗原或抗体后，利用激光共聚扫描技术或荧光扫描仪检测芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析各种待测样本中蛋白质。蛋白质芯片技术广泛用于寻找新药作用的靶点、肿瘤标志物检测(如C-12蛋白质芯片检测)、科研等方面[29]。王丽豪等[30]采用蛋白质芯片(美国RayBiotech公司提供的蛋白质芯片AAH-CYT-G1000)对脑脊液中120种细胞因子进行筛选，检出83种细胞因子，通过对62例入组患者(30例结核性脑膜炎、16例非感染性神经系统疾病和16例病毒性脑膜炎)脑脊液细胞因子含量的分析比较，最终筛选出γ-干扰素、IL-8和单核细胞趋化蛋白-2是结核性脑膜炎的诊断性细胞因子。张仁卿等[31]用南京大渊生物技术公司提供的结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒对420例结核病患者血液标本进行检测，结果其诊断涂阳肺结核的阳性率最高(76.15%)，得出结核蛋白质芯片固定TBAg蛋白16 000、38 000、结核分枝杆菌特异性细胞壁脂多糖抗原(LAM)三抗体联合检测可提高结核病的阳性检出率和诊断准确率，该试验对结核病具有一定辅助诊断价值。该方法所需检测样本量少、高通量(可同时对几万个目标蛋白质进行高通量平行检测)、能通过标准曲线进行定量检测、高灵敏度(利用抗原抗体高度特异性结合的特点)、快速(半小时出结果)、方便和微型化、人为主观误差降低(自动化)，具有检测出各种待测样本中蛋白质的种类(结构)、量和功能的能力，同时亦能检出小肽、受体、抗体、蛋白质-DNA、配体、抗原和蛋白质-RNA复合物等[32]。但也存在一些不足：(1)机体待测抗体的分布和数量，由于受到患者免疫状态及体内结核分枝杆菌数量的影响，会导致假阴性结果出现；(2)无法区分以往感染或现症感染者(由于IgG抗体的免疫特点引起)[33]。总之，结核蛋白质芯片是近几年来结核病血清学研究中的一种新方法，在结核病临床诊断、疗效评估及科学研究等方面具有广阔的应用前景。

3 小结

综上，当前结核病免疫学检测新技术已经逐步向以下方向发展：样本量微量化；样本类型多样化(包括血液、尿液、粪便、组织和浆膜腔积液等)；检测流程自动化；实效性强(床旁检验)；兼容性强(实时、远程、网络化)；多学科交融(如融合基础医学、免疫学、分子生物学、纳米技术以及电化学发光技术等)；对结核病诊断的正确性高，具有一定的抗痨疗效评估价值；实验器材便携且成本低；操作流程简单化(无需配备专业技术人员)等。当前新技术仍不能准确区分不同类型的结核病(如活动性结核病与结核潜伏感染人群)，仅能用于临床结核病的辅助诊断，而不能用于确诊结核病，在当前众多新技术临床应用价值研究中，大部分研究尚未对不同人群、不同类型结核病等进行大样本临床验证，新技术临床诊断性能的普适性尚需进一步深入探讨。只有充分研究每一个新技术的检测原理、优缺点及适用范围，才能对其做到合理的应用，才能最大限度地发挥其价值。尽管世界卫生组织鼓励对血清学试验进行研究，但本综述中的大多数结核病免疫学诊断新技术仍不够成熟，需要进一步深入研究、提炼和优化，并进行多中心、多地区、大范围和多种族的临床验证，以期能更好地为全球结核病的防治助力。