泛素特异性蛋白酶24的作用机制及研究进展*

顾锦 综述，史伟峰 审校

(苏州大学附属第三医院检验科，江苏常州 213003)

蛋白质的泛素化是真核细胞内蛋白质翻译后的共价修饰，具有调节细胞增殖、分化与凋亡等多种生物学功能。泛素分子是一种广泛存在于真核细胞内的小分子多肽，由76个氨基酸残基组成，泛素化修饰可将靶蛋白按蛋白酶体途径或溶酶体途径降解[1]。与其他的翻译后修饰类似，泛素化修饰是一个可逆的过程，泛素链可被去泛素化酶剪切，泛素特异性蛋白酶24(ubiquitin-specific protease 24，USP24)通过将泛素链与底物蛋白质之间的连接以及泛素化链之间的连接裂解并切断，使泛素化蛋白质底物或蛋白酶体降解底物上的单泛素分子脱离出来，从而防止多聚泛素在底物蛋白质聚集，单泛素分子可以重新进入细胞内蛋白质调节的循环中，维持游离泛素和泛素结合蛋白的动态平衡。USP24被报道在骨骼肌表达最高，其次是在卵巢，而在心脏、脑、肺、肝和肾脏呈中度表达，在胰腺、脾脏和睾丸呈低度表达[2]。目前，USP24被报道的研究主要有代谢、肿瘤发生发展、感染免疫、细胞周期调控等方面，其更多机制和生物学功能有待进一步深入研究。

1 USP24的结构和功能

最初USP24基因是在2005年由Oliveira等[3]发现,他们为了确定1p号染色体连锁区域(LOD=3.41)上控制帕金森病(Parkinson′s disease, PD)发病年龄(AAO)的基因，使用了267个PD多发家族的整体数据集，采用迭代关联映射法，从而确定了该区域的6个相关基因，但进一步筛选与1号染色体位点相关的83个家族的子集，则仅发现了PD中与AAO显著相关的2个基因，其中一个就是USP24基因。USP24定位于人1p32.3，含有2 620个氨基酸，68个外显子，属于半胱氨酸蛋白酶家族。USP24由泛素相关结构域(UBA)、泛素结构域(UBL)和泛素特异性蛋白酶结构域(USP)三部分组成，其中1 697位半胱氨酸是蛋白酶结构域的关键位点[4]。另外在DNA损伤后USP24 1 620位丝氨酸突变为丙氨酸，S1620A突变降低了USP24对P53的稳定作用，这表明S1620可能是USP24共济失调毛细血管扩张突变蛋白(ataxia telangiectasia mutated，ATM)磷酸化位点。目前研究表明，USP24的靶蛋白包括转录因子、信号传导分子以及一些酶,近年来研究报道了一些USP24作用的底物，USP24可以与肿瘤抑制因子p300和凋亡诱导因子Bax结合抑制肿瘤的发生，与细胞真核转录因子E2F-4相互作用影响细胞G1-S过渡期进程[5]；USP24还可以与肿瘤抑制因子p53、损伤特异性DNA结合蛋白2(damage specific DNA binding protein 2，DDB2)结合参与DNA损伤修复应答[6]；USP24去泛素化抗凋亡蛋白MCL-1稳定其活性促进了肿瘤的发生，抑制USP24的表达可以促进肿瘤细胞的凋亡[7]；最新研究报道USP24通过影响ULK1蛋白的泛素化和稳定性来调节PD患者多巴胺能神经元细胞的自噬[8]。更多与USP24相作用的底物仍有待进一步发现。

1.1USP24与肿瘤细胞 Wang等[9]发现USP24在晚期肺癌临床样品中高表达，他们使用肺癌患者基因组DNA研究USP24的单核苷酸多态性(SNP)，发现SNP 7656C/T升高；当使用RNA标本代替肺癌患者的基因组DNA时，发现930C/T和7656T/C突变体的比例显著增加，表明这两个位点的突变体不仅由DNA的SNP引起，而且由RNA编辑引起；USP24变异体分析显示，肺癌患者血液样本中变异体比例明显高于正常个体，因此认为USP24-930T和USP24-7656C可以作为肺癌检测的诊断标记；还发现鼠双微粒2(murine double minute 2, MDM2)是USP24作用的底物，过表达USP24可以上调MDM2导致Suv39h1甲基化酶水平降低，从而减少了H3K9的甲基化，并启动了肿瘤转移相关基因ADAM9(ADAM metallopeptidase domain 9)、ADAM10(ADAM metallopeptidase domain 10)和CCL5(C-C motif chemokine ligand 5)的表达，最终导致肺癌的转移。

Wang的团队揭示了USP24在肺癌转移过程中的作用后，继续研究了USP24在癌症形成过程中的作用，发现USP24正性调控了肿瘤的转移，却负性调控了肿瘤的发生。Wang等[5]发现Bax和p300是USP24的底物。p300是一种肿瘤抑制因子，而Bax是一种可以防止癌症形成的凋亡诱导因子，Ku70乙酰化作用会增加Bax的线粒体定位，从而导致细胞凋亡。在癌症早期和细胞周期的有丝分裂阶段，USP24因磷酸化导致其水平降低，其底物蛋白p300、Bax表达减少从而抑制细胞凋亡形成癌症。然而，过表达的USP24则增加了Bax水平和Ku70乙酰化介导的Bax线粒体转运增加细胞凋亡，抑制了肿瘤的发生。细胞周期进程中G1-S过渡是癌症形成的关键阶段，真核转录因子E2F包含3个激活剂成员E2F1、E2F2和E2F3，2个抑制剂E2F3b和E2F4。E2F4通过抑制E2F1的转录活性而参与细胞周期进程的调节。USP24基因下调可降低E2F4，p130和TFDP1导致E2F1水平增加，随后G1-S过渡增加，从而导致肿瘤发生。

近年来，Wang等[10]又发现USP24在M2巨噬细胞和人晚期肺癌细胞系A549中表达上调,USP24通过p300和β-TrCP稳定以增加组蛋白H3乙酰化和NF-κB启动子的水平，从而增加M2巨噬细胞和肺癌细胞中的转录诱导肿瘤相关微环境中的IL-6并促进肿瘤恶化。Transwell实验证明了使用USP24敲减的M2巨噬细胞的条件培养基降低了肺癌细胞的迁移和趋化活性。另外，将微血管内皮细胞株1(HEMC-1)和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)与USP24敲除的M2巨噬细胞共培养后，发现其微血管的形成能力被显著抑制。继而发现USP24基因敲除后的M2巨噬细胞和A549细胞分泌IL-6水平下降；将2 ng/mL的IL-6加入USP24敲除的M2巨噬细胞培养液中，结果显示A549细胞的迁移和侵袭能力增强。同时证实USP24通过稳定肺癌细胞中β-Trcp分子以及肺癌细胞、M2巨噬细胞中p300分子，促进IL-6的上调表达。将USP24基因敲除的CL1-5人肺腺癌细胞通过尾静脉注射到SCID小鼠体内，观察到USP24基因敲除的癌细胞中肺结节数量减少。结果表明，USP24上调与肺癌的恶性程度及肿瘤血管生成活性密切相关。因此研究证明通过调控USP24可为治疗肿瘤提供新的途径。

髓样细胞白血病分子-1(myeloid cell leukemia-1，MCL-1)属于Bcl-2家属成员之一，对T、B淋巴细胞及巨噬细胞等生存非常重要[7]；MCL-1水平在淋巴瘤、慢性髓细胞白血病和多发性骨髓瘤中异常升高[11]。Schwickart等[12]发现，卵泡淋巴瘤和弥漫性大细胞淋巴瘤MCL-1蛋白的增加与 USP9X表达的上调有关，后者通过K48去泛素化稳定抗凋亡蛋白MCL-1，从而促进肿瘤细胞生长。Peterson等[13]发现USP24与USP9X密切相关，USP9X敲除的细胞中USP24代偿性上调，从而维持骨髓瘤细胞的存活和MCL-1的调节作用；当USP24敲除时可导致骨髓瘤细胞死亡；新型化合物EOAI3402143剂量依赖性地抑制USP9X和USP24活性，增加肿瘤细胞的凋亡，而且比直接抑制MCL-1更有效地促进肿瘤细胞凋亡，并完全阻断或消退小鼠的骨髓瘤肿瘤。此研究提示抑制去泛素化酶的活性有望成为治疗骨髓瘤和其他B细胞肿瘤新的策略。

1.2USP24与神经退行性疾病 PD是由黑质多巴胺能神经元的进行性和选择性丢失所致的第二种常见神经系统退行性疾病。尽管PD的发病机制还不清楚，但近来研究表明泛素-蛋白酶体通路的缺陷是导致PD的病因之一。Oliveira等[3]研究发现，USP24基因位于PD的Parkin基因10易感位点区域，与PD的发病密切相关。Li等[14]发现USP24和USP40基因中的许多SNP与迟发性PD的发生有关，USP24和USP40的基因变异可导致白种人迟发性PD的风险增加。Wu等[15]发现在60岁以上的中国台湾人群中，USP24的rs487230位点基因型和等位基因频率在PD患者和对照组之间有明显的差异，等位基因T和CT/TT基因型能够减少PD的发病风险，然而，这一结论在中国大陆尤其是汉族人群中尚未得到证实。Zhao等[16]挑选我国西南地区378例汉族PD患者与同地区274健康人对照，采用单碱基延伸技术分析多个SNPs，包括USP24的rs13312、rs1165226、rs487230和rs287235，以及USP40的rs1048603，结果表明PD组与对照组、早发性PD组与对照组、迟发性PD组与对照组、早发性PD组与迟发性PD组的基因型频率、小等位基因频率均无显著差异；该研究首次报道中国汉族患者中USP24和USP40的SNPs与PD之间缺乏相关性。另外，USP24的rs287235小等位基因‘G’降低了挪威人发生PD的风险，但在美国人、爱尔兰人以及其他白种人中未得以证实[17]。Wang等[18]从基因的转录调控着手，对人类USP24基因启动子功能进行分析，发现其含有一个NF-κB结合位点。为检测USP24基因启动子活性是否受NF-κB调控，进一步将 USP24p-C质粒与NF-κB表达载体及相应的空载体pMTF共转染到HEK293和N2a细胞中，荧光素酶检测结果显示，NF-κB表达显著增加了HEK293和N2a中USP24启动子活性。当NF-κB信号被其特异性激活剂TNF-α激活或NF-κB水平升高时，USP24基因启动子活性增强；当NF-κB在启动子上的顺式作用元件被删除或突变时，USP24基因启动子活性降低。因此，上述研究表明人类USP24基因启动子受NF-κB的调控，NF-κB在细胞凋亡和炎症中起着重要作用，而凋亡和炎症均为神经退行性疾病发病机制的重要特征。最近Thayer等[8]指出自噬缺陷与PD多巴胺能神经元变性之间存在因果关系，确定USP24是位于帕金森病10 (Parkinson disease 10)易感性基因位点与晚发性PD相关的基因。研究表明，USP24通过影响ULK1蛋白的泛素化和稳定性来调节自噬，USP24在人诱导多能干细胞(iPSC)分化为多巴胺能神经元中的下调导致ULK1蛋白水平升高和自噬的增加,USP24敲除改善了衰老的iPSC衍生的多巴胺能神经元的神经突扩展和/或维持,然而USP24对PD患者iPSC衍生神经元的影响还有待进一步的研究。

1.3USP24与DNA的损伤修复 细胞内DNA损伤可受多种因素影响。在体内主要有活性氧、细胞代谢产物、拓扑异构酶缺失导致的错配等因素；而在体外主要与电离辐射(IR)、紫外线(UV)及环境致癌物等有关。DNA损伤修复应答过程包括诱导损伤部位的重新定位、信号传导、修复因子进入DNA损伤部位并进行修复等过程[19]。目前，研究发现去泛素化已经成为调控DNA修复途径的重要机制之一。其中DDB2参与DNA损伤识别的核苷酸切除修复途径(nucleotide excision repair，NER)，为染色质DNA双链断裂(DNA double strand breaks，DSBs)有效修复关键分子。DDB2是CRL4-DDB2-E3连接酶的一个成分，该连接酶以着色性干皮病基因组C(xeroderma pigmentosum group C，XPC)、组蛋白和DDB2本身为靶标[6]。DDB2被认为是针对DNA损伤位点的E3连接酶复合物的底物受体。Zhang等[4]采用酵母双杂交筛选人cDNA文库来鉴定潜在的DDB2底物，经免疫共沉淀法证实USP24为DDB2相互作用蛋白。将HeLa和293T两种细胞中USP24基因敲除后，其DDB2的稳态水平下降，说明USP24是一种新的DDB2稳定调节分子，其去泛素化作用可阻止DDB2的降解，从而维持了DDB2的稳定性。

抑癌基因p53在50%以上恶性肿瘤中可发生突变。P53也是一种半衰期很短的蛋白质且受到泛素化和去泛素化的严格调控[20]。p53被MDM2和其他几种E3连接酶泛素化，并被许多去泛素化酶(DUB)去泛素化，包括USP7、USP10、USP11、USP29、USP42、OTUD1和OTUD5[4]。那么这么多DUB如何进行协调以维持p53稳定性和活性，原因可能有多种。首先，不同的DUB可能会响应不同的细胞应激来调节p53,USP24是一种新发现的P53去泛素化酶，在紫外线诱导的DNA损伤时起到稳定P53的作用。HCT116细胞经紫外线照射(254 nm，20 J/m2)后，其P53趋于稳定且水平迅速升高，当USP24蛋白耗尽时，P53水平则显著下降，P53的稳定程度与细胞内USP24蛋白的残留呈正相关。USP24基因缺失时，HCT116细胞中P53的稳定性被破坏，而USP24表达重建可恢复P53的稳定，表明USP24在紫外线诱导的P53稳定中发挥重要作用，是紫外线损伤应答的一种调节因子[21]。

1.4USP24与病原体感染 巨细胞病毒(HCMV)是一种缓慢复制的疱疹病毒，在成纤维细胞中需48～72 h达到增殖高峰。因此为了有足够的时间来完成其复制周期，HCMV编码如pUL36、pUL37x1和pUL38等蛋白质来阻止未成熟细胞死亡。USP24基因敲除可抑制pUL38缺陷型HCMV感染过程中的细胞死亡，提示pUL38通过和USP24相互拮抗实现其功能。而且，pUL38通过阻断USP24介导的铁蛋白在溶酶体中的降解来维持溶酶体的完整性和细胞活力。敲除USP24基因则可降低溶酶体中核受体辅激活物4(nuclear receptor coactivator 4，NCOA 4)的稳定性和铁蛋白重链的降解[22]。研究阐明USP24通过调节铁代谢来提高宿主的抗病毒作用，那么USP24能否在固有免疫通路中结合转录因子来调节机体抗病毒反应目前尚未有研究报道，USP24与其他去泛素化酶对固有免疫的调节是否有异同点仍然值得深入研究。

1.5USP24与精子发育 Hu等[23]发现小鼠性器官USP24主要定位于睾丸的支持细胞和生精细胞的细胞质中，受雄激素受体(androgen receptor，AR)调控，而AR主要在小鼠睾丸的支持细胞、间质细胞和管周样肌细胞中表达；USP24被确认为是AR下游的一个靶基因，其表达水平的升高与小鼠的性发育有关，USP24可能参与了调控小鼠的精子发生过程。目前对于USP24参与调控人类精子细胞的研究尚未报道，仍待进一步研究。

2 小结

去泛素化酶通过剪切底物蛋白K48、K63等连接的多聚泛素化链，影响靶位蛋白的稳定性，调控蛋白质的代谢，因而去泛素化酶活性的异常改变是诱发肿瘤、感染、自身免疫性疾病等主要原因之一。目前研究表明USP24与肿瘤、神经退行性疾病、DNA损伤修复、病毒感染等疾病的发生、发展密切相关，但目前其作用及机制研究仍不够深入。因此，进一步采用蛋白质组学、比较基因组学和表观遗传学等方法寻找USP24相互作用的靶蛋白及其相关的调控因子，或可为治疗上述疾病提供理论依据和新的策略。