过敏原特异性IgE抗体实验室检测及其临床应用

2020-02-27 15:44:32李会强天津医科大学医学检验学院天津300203
临床检验杂志 2020年11期
关键词:包被过敏原过敏

李会强(天津医科大学医学检验学院,天津 300203)

近年来,过敏性疾病发生率不断提升,已成为严重影响人类健康的公共卫生问题[1]。过敏性疾病主要指由免疫球蛋白E(immunoglobulin E,IgE)介导,组织中肥大细胞和外周血中嗜碱性粒细胞参与,通过释放生物活性介质引起局部或全身症状的Ⅰ型超敏反应所致疾病。过敏性疾病的诊断包括询问病史、体外诊断和体内试验,其中体外诊断发挥重要的作用,而过敏原检测是重要的体外诊断项目之一[2]。过敏原检测并不是真正检测过敏原(抗原),而是通过检测过敏原特异性IgE(specific IgE,sIgE)抗体间接推断待检者是否对相应物质过敏(确定过敏原)。过敏原sIgE抗体(过敏原)检测作为过敏性疾病的病因学诊断依据,对过敏患者的诊断、指导脱敏治疗和评价特异性脱敏治疗效果以及评估接触过敏原带来的风险具有重要价值[3]。同时,筛查过敏原对于疑似过敏患者的预防也非常重要。

1 血清学检测及其常用方法

1.1血清学检测 血清学检测用于检测分布于血清中的游离状态sIgE(free sIgE,F-sIgE)抗体,此类抗体尚未结合肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面的受体。血清学检测基于抗原抗体特异性结合的免疫学原理,采集外周血分离血清,用已知抗原(过敏原)作为探针,特异性捕获血清中F-sIgE,并通过标记免疫技术对信号放大,确保分析灵敏度和特异性。血清学方法的分析模式包括间接模式和捕获模式。间接模式是检测sIgE抗体的经典模式,相对比较成熟[4]。捕获模式采用抗人IgE抗体包被固相材料,捕获血清中IgE(待检sIgE抗体和非待检sIgE抗体),生物素化过敏原识别并结合待检sIgE抗体[5]。间接模式需要将捕获抗原包被固相材料,无论是物理吸附还是化学连接,对于混合组分抗原而言,固相包被过程是检测试剂制备的难点。其次,对于间接模式而言,如待检标本中含有针对此蛋白质的IgG类抗体,会消耗固相抗原分子数量而影响检测结果。为此,间接模式的关键是固相包被问题,包括包被抗原的质量和分子数量。而捕获模式只需将抗人IgE抗体(二抗)包被固相材料,无需包被组分复杂的过敏原溶液,可规避间接模式的不足。但是,由于固相表面面积有限,抗人IgE抗体分子数对于标本中人IgE分子数量相对不足(固相表面包被的抗人IgE抗体捕获的并不是专一过敏原sIgE抗体,其他非待检sIgE抗体会竞争性结合捕获抗体),从而影响待检sIgE抗体的分析灵敏度。

1.2常用方法 放射过敏原吸附试验(radio allergen sorbent test,RAST)于1967年由Wide建立,是最早的sIgE抗体检测方法[6]。目前,过敏原sIgE抗体血清学检测方法包括斑点-酶免疫吸附试验(dot-enzyme-linked immunosorbent assay,Dot-ELISA)、ELISA、荧光酶免疫分析(fluorescence enzyme immunoassay,FEIA)以及酶促发光免疫分析。

1.2.1斑点-酶免疫吸附试验(Dot-ELISA) 德国敏筛、欧蒙生物、浩欧博、艾康生物等国内外品牌试剂将Dot-ELISA简称为“膜条法”。此方法以硝酸纤维素(NC)膜为固相载体,于膜条不同位置包被不同过敏原组分(已知抗原),作为检测线(T),同时,设定阳性对照线(C)。测定时将膜条润湿,加入待检血清标本,与膜条共同温育,血清中待检抗体与膜条预包被抗原发生抗原抗体特异性结合;洗涤膜条,加入碱性磷酸酶(AP)标记的抗人IgE抗体(或通过生物素标记的抗人IgE抗体和AP标记的亲和素),温育,标记抗体与待检sIgE抗体结合;洗涤膜条,加入AP底物溶液(BCIP-NBT)显色,洗涤膜条,经检测仪扫描光斑密度,得到每种过敏原sIgE抗体强度(半定量)。

Dot-ELISA是国内临床实验室较为广泛使用的方法[7]。此方法特点包括:(1)膜条多位置分别包被多种已知过敏原,可同时检测多种过敏原sIgE抗体,符合临床早期过敏原筛查需多项过敏原同时检测的要求;(2)NC膜采用物理吸附方式包被过敏原,适合各种性质不同的蛋白质,且吸附蛋白质能力较强;(3)已有全/半自动检测仪,标准化操作,节省人力资源;(4)具有较低检测成本,便于推广使用。然而,Dot-ELISA也存在不足之处,如:Dot-ELISA不能准确定量,且检出限(分析灵敏度)有待提高,整体检测时间尚需缩短,单位时间检测通量需要提升。

1.2.2ELISA ELISA以微孔板作为固相载体,辣根过氧化物酶(HRP)标记抗原或抗体,酶联仪测定吸光度(A)值,是一种定量分析系统。过敏原sIgE抗体的检测比较适合捕获分析模式,即采用抗人IgE抗体预先包被微孔板,用于捕获血清中所有IgE分子,再经生物素标记的过敏原(Bio-Ag)和HRP标记的亲和素(HRP-SA)显色。适宜捕获法的原因包括:(1)微孔内包被抗人IgE抗体,无需包被不同过敏原,方便规模化生产,规避不同蛋白质对包被方法的不同要求[8];(2)采用生物素标记过敏原组分,再经HRP标记的亲和素显色,引入亲和素和生物素系统,具有更高的分析灵敏度;(3)可随机组合过敏原项目,适应不同科室标本;适合动态sIgE抗体监测单一过敏原;(4)与Dot-ELISA相比,ELISA更适合定量分析,过敏原sIgE抗体定量检测有助于临床诊断和病情监测。受微孔板包被面积限制,高总免疫球蛋白E(total IgE,tIgE)标本会影响目标sIgE抗体结合,从而影响分析灵敏度。此外,在ELISA基础上更换为发光底物,称之为酶促化学发光分析(enzymatic chemiluminescence analysis,ECLIA),如北京新华联公司产品。与色源信号相比,光信号更加敏感,ECLIA方法其他性能同ELISA方法。

1.2.3荧光酶免疫分析(FEIA) 采用FEIA技术开发的过敏原sIgE抗体检测试剂的商品名为“Immuno-CAP”,此方法被视为sIgE抗体检测的金标准[9]。FEIA-sIgE抗体检测技术以β-D-半乳糖苷酶标记的抗人IgE抗体作为标记抗体,同时,将已知过敏原包被在经活化的多孔弹性纤维素材料(此固相材料具有较强蛋白质吸附功能,可容纳足够抗原分子,具有独特优势)上并制备成干燥帽状试剂。Immuno-CAP为一全自动荧光免疫分析系统,根据欲检测sIgE抗体的种类,选择帽状抗原放在反应杯内,加入血清标本温育,待检sIgE抗体即被固相抗原捕获;洗涤后加入β-D-半乳糖苷酶标记抗人IgE抗体,温育,酶标抗体与待检sIgE抗体结合;洗涤后加入荧光底物 4-甲基伞形酮-β-半乳糖苷(MUG),经β-D-半乳糖苷酶水解产生中间物质4-甲基伞形酮(4-MU),经激发光(波长364 nm)激发后产生荧光信号(波长448 nm)。Immuno-CAP过敏原sIgE抗体检测系统具有全自动分析的优势,且已知过敏原为单独试剂,方便根据临床需求随机组合,同时FEIA技术具有很高的分析灵敏度,对过敏原sIgE微弱阳性婴幼儿患者的检测具有更大优势[10]。

1.3血清学sIgE抗体检测的量值溯源 过敏原sIgE抗体定量分析具有更重要的应用价值,而准确定量的前提是采用国际标准物质或国家标准物质作为参考物质,同时具备可靠的参考方法以及完美量值溯源环节。目前,已有IgE的国家标准物质GBW(E)090607,但不存在过敏原sIgE抗体的标准物质。sIgE抗体定量是通过共用IgE校准曲线实现的,并非通过各自sIgE校准曲线而获得。为此,采用已标定系列人IgE校准品溶液,与相应的检测信号值之间建立某种数学函数,各种过敏原sIgE的含量是将信号值代入函数而获得。同时,血清tIgE的单位采用“KU/L”表示,而过敏原sIgE的单位用“KUA/L”表示。IgE校准品量值溯源需用免疫分析方法溯源至国际标准物质或国家标准物质,并由多个权威实验室联合定值。用国家标准物质或国际标准物质给生产商工作校准品定值,经过工作校准品再给试剂盒中的产品校准品定值。在上文提到的3种方法中,Immuno-CAP隶属定量方法,且采用FEIA方法,分析灵敏度满足临床要求。

此外,因血清学检测方法基于抗原(过敏原)与待检sIgE抗体之间特异性结合,反映二者之间亲合力的强弱。但是,体外过敏原-sIgE抗体结合,不同于体内结合型sIgE抗体结合过敏原形成“抗原桥”后所致的脱颗粒过程。血清学检测不能准确反映过敏原sIgE抗体在体内所致的病理效应,只能反映体内针对此种过敏原sIgE抗体的蛋白质含量。血清学检测结果也不能准确反映过敏患者的临床表现。此外,血清学检测的关键是高质量的捕获抗原(过敏原),如捕获抗原不够精细化,存在抗原缺失或活性降低等因素,将严重影响sIgE抗体检测的准确性[11]。

2 细胞学检测及其常用方法

2.1细胞学检测 肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面的sIgE抗体被称为结合状态抗体(bond sIgE,B-sIgE)。细胞学检测基于细胞生物学原理,直接用过敏原体外激发外周血嗜碱性粒细胞,检测细胞表面B-sIgE抗体的生物活性[12]。细胞学检测方法基于致敏细胞活化过程设计,模拟体内嗜碱性粒细胞活化过程,真实反映过敏原sIgE抗体生物活性,与过敏患者的临床表现具有较好相关性。

2.2常用方法 最初的细胞学检测方法通过检测组胺释放量实现,操作复杂且重复性差,不宜推广。1991年Knol等[13]发现嗜碱性粒细胞活化后表达CD63分子,随后建立嗜碱性粒细胞激活试验(basophils activation test,BAT)。除CD63外,CD203c同样是嗜碱性粒细胞活化的重要标志分子[14]。CD63属于溶酶体克隆糖蛋白,细胞未激活时固定于溶酶体颗粒膜表面。嗜碱性粒细胞活化时,经胞吐作用颗粒与质膜融合,转移至细胞膜表面同时释放组胺[15]。因此,细胞表面CD63的表达变化可反映嗜碱性粒细胞的活化程度。目前,采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)实现BAT检测[16]。首先,收集外周血细胞或分离外周血单个核细胞,加入已知过敏原溶液中短时间共同温育,过敏原与致敏细胞表面sIgE抗体结合并诱导嗜碱性粒细胞活化;其次,分别加入FITC-anti-CD123 Ab、PE-anti-HLA-DR Ab、APC-anti-CD63 Ab,温育后进行荧光抗体染色;然后,用流式细胞仪检测,分别通过侧向角散射光强度、前向角散射光强度,结合FITC-anti-CD123 Ab阳性、PE-anti-HLA-DR Ab阴性,圈选嗜碱性粒细胞群,再结合APC-anti-CD63 Ab染色阳性,计数活化的嗜碱性粒细胞百分数量。阳性对照采用抗FcεR抗体,阴性对照采用抗体稀释液。

BAT需采用新鲜血液才能保证细胞活性状态,在一定程度上限制了其在临床实验室的广泛使用。随着基因工程技术的发展,通过改造细胞建立的抗体介导的细胞学检测,同样适用于检测血清标本F-sIgE抗体的生物学活性。首先,将待检血清致敏人工构建的嗜碱性粒细胞细胞系(相当于血清致敏BAT,sIgE-BAT);随后,同新鲜血BAT,加入已知过敏原激发致敏细胞,再检测致敏细胞释放的物质,观察细胞活化和脱颗粒的情况[17-18]。

目前,BAT已在临床实验室开展,此方法具有准确度高的优点,可精确反映嗜碱性粒细胞活化程度和功能状态,对于间接评估过敏性疾病的严重程度,动态监测过敏性疾病的发展以及指导临床治疗具有重要价值[3,19-20]。

3 过敏原sIgE抗体组分诊断

过敏原sIgE抗体为混合抗体,不同个体间存在抗体异质性。过敏原sIgE抗体的异质性指对同一物种过敏的不同个体内,针对不同蛋白质的sIgE抗体种类和数量存在差异,同时,针对同一蛋白质、不同抗原表位的sIgE的种类和含量也存在差异。除药物分子外,引起过敏的食物、花粉、真菌等物质所含蛋白质组分比较复杂,诱导机体过敏的往往不是单一蛋白质组分,且个体间存在差异。无论何种过敏(物种层面)所产生的均不是单一sIgE抗体,不仅是一组针对不同蛋白质的sIgE抗体的混合物,而且是针对同一蛋白质的不同抗原表位的sIgE单克隆抗体的混合物,sIgE抗体具有群体多样性和个体差异性[21]。

无论细胞学检测还是血清学检测,如以单一物种所含过敏组分总和作为探针,如物种蛋白质提取溶液或经过适当增补,即以混合蛋白质组分作为抗原来检测sIgE抗体的诊断方法,称之为混合组分诊断(mixture resolved diagnostics,MRD)。相反,如以单一蛋白质(抗原)作为探针,检测只针对此种抗原的sIgE抗体的诊断模式,称之为单一组分诊断(component resolved diagnostics,CRD),习惯称为“单组分诊断”或“组分诊断”。

早期过敏原检测属于混合组分诊断且一直沿用至今。由于早期人们对过敏原组分认识不够深入,特别是受蛋白质分离纯化技术以及重组蛋白质技术的限制,或是受物种中某种过敏原丰度的限制,往往很难获得单一蛋白质组分。为此,用于过敏原sIgE抗体检测的抗原原料多采用物种蛋白质抽提溶液,即多种蛋白质的混合物。由于蛋白质抽提溶液几乎包含所有过敏组分,国外学者称之为全过敏原组分诊断。实际上,受提取方法、蛋白质稳定性和蛋白质丰度限制,收获全部过敏组分亦较为困难。MRD存在如下问题:(1)原材料来源不同(物种差异、成熟程度等),收获的蛋白质存在差异;(2)选用提取方法不同,导致收获的蛋白质存在差异;(3)采用同一种固相包被的方法并不适用于提取液中的每一种蛋白质。 基于上述原因容易造成不同检测试剂质量参差不齐,影响过敏原sIgE抗体检测结果的一致性。蛋白质纯化技术的进步,基因重组蛋白质技术的广泛应用以及新型抗原包被技术的出现,有利于在原有蛋白质抽提溶液中增加重要过敏原组分,平衡不同过敏原的浓度和比例,提高过敏原的包被效率,显著改进检测试剂的质量。

随着蛋白质分离技术的不断发展,双向电泳和蛋白质谱技术用于过敏原的组分分析,以及基因重组技术、抗原表位分析技术的快速普及使用,越来越多过敏原组分被分离鉴定出来,基于单一蛋白质组分的sIgE抗体诊断概念应运而生。如禽蛋蛋清过敏原包括卵类黏蛋白(Gal d l,OM)、卵白蛋白(Gal d 2,OA)、卵转铁蛋白(Gal d 3)、溶菌酶(Gal d 4)。此时,单一组分蛋清sIgE抗体诊断包括上述4种蛋白质各自sIgE抗体谱的含义。CRD是基于蛋白质分子水平上,用纯化的天然蛋白质或基因重组蛋白质作为已知抗原,来捕获待检过敏原sIgE抗体的一种新方法[22-23]。Immuno-CAP就提供组分诊断:CRD-sIgE抗体检测试剂(科研用),来适应过敏原CRD模式,可对过敏患者提供更精准的检测结果,为精准脱敏治疗提供帮助[24]。过敏原sIgE抗体CRD模式能够克服MRD模式的众多缺陷,显示出独特优势和应用前景:(1)从免疫学方法角度来说,单组分抗原与抗体结合受到的干扰因素少,检测结果更准确;(2)可获得过敏原sIgE抗体谱,使临床诊断更加精准,诊断价值更大[23];(3)有利于发现具有交叉反应的过敏原,指导过敏患者规避相关食物;(4)sIgE抗体谱反映个体异质性,易于有针对性地特异性脱敏治疗[25]。然而,CRD sIgE抗体检测同样存在局限性,一些尚未鉴定出的过敏原不能被检测,需要不断丰富对过敏原组分的认识。此外,多种过敏原sIgE抗体谱检测需要高通量的检测系统(试剂)作为技术支持。sIgE抗体谱的诊断价值尚需深入挖掘和不断实践。

4 小结

过敏原sIgE抗体用于过敏原检测,为过敏性疾病的诊断提供了病因学证据。过敏原sIgE抗体检测结果的准确性主要依赖于所有过敏原(已知抗原)的质量,同时部分取决于所使用的技术手段。过敏原sIgE检测包括CRD和MRD,而CRD的结果更为准确,为临床诊断和治疗提供了更多支持。从技术方法学角度来说,过敏原sIgE抗体检测也从最初的定性分析发展到目前的定量分析,以适应临床诊断的新标准,同时,对于婴幼儿过敏患者则需要更高的分析灵敏度。此外,细胞学检测方法能够反映sIgE抗体的致病活性,与临床表现呈现较好的相关性,但由于操作的复杂性,对技术要求高等因素,尚不能在常规临床实验室推广使用。同时,通过血清单组分sIgE检测方法的建立以及建立适于推广的细胞学检测,将有助于精准治疗,是过敏诊断的发展方向之一。

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