不同剂量枸杞多糖对高糖诱导的RSC96雪旺细胞增殖的影响比较

刘思阳，马巧丽

糖尿病周围神经病变(DPN)是绝大多数糖尿病患者最常出现的慢性并发症[1]，其发病机制非常复杂，且尚未完全阐明，目前缺乏有效的治疗方法[2]。枸杞多糖(LBP)是从我国传统中药枸杞子中提取的最重要的有效成分。研究证实，LBP可通过抗氧化应激、清除病变小鼠体内过量自由基保护DPN[3- 4]。雪旺细胞是周围神经系统主要的神经胶质细胞，在周围神经的增殖、功能及再生中起重要作用[5]。但LBP对体外培养的高糖诱导下的雪旺细胞的保护作用报道较少，其最佳剂量未见深入研究。本实验对LBP的有效剂量进行了相关分析，为今后的研究提供数据支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料：LBP(宁夏回族自治区农林科学研究院，批号：018006，批间差异为3%)；杜氏改良Eagle低糖培养基(DMEM)(美国HyClone 公司，批号：M3024-10X1L，批间差异为3%)；胎牛血清(FBS)(美国Gibico 公司，批号：VS500T，批间差异为5%)；甘露醇(美国Siama公司，批号：B20422，批间差异为1.5%)；葡萄糖粉末(上海广锐生物科技有限公司，批号：016047，批间差异为3%)；四甲基偶氮唑盐(MTT)检测试剂盒(南京凯基生物技术有限公司，批号：A0389，批间差异为1.5%)；RSC96细胞(大鼠永生化雪旺细胞株，上海中乔新舟生物科技有限公司，批号：A1044，批间差异为5%)；ST-360酶标仪(美国Bio-tek公司)。

1.2 细胞培养与分组

1.2.1 RSC96细胞复苏及培养：将RSC96 细胞从液氮罐中取出，快速放入37 ℃水浴锅解冻约1 min，将细胞悬浮液(1 mL)吸入15 mL离心管内并加入 1 mL DMEM 完全培养基；混匀后1 000 r/min 离心5 min，弃上清液，加入 5 mL含10%FBS、1%双抗、5.5 mmol/L葡萄糖的完全DMEM培养基；置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。显微镜下观察复苏的 RSC96细胞生长状态，当细胞生长状态良好且铺满100 mm细胞培养皿的90%时进行细胞传代。1～2 d换液1次，2～3 d传代。取对数生长期RSC96细胞进行后续实验。

1.2.2 实验分组：高糖诱导细胞凋亡实验，根据培养基中葡萄糖浓度分为以下4组：12.5 mmol/L组(含葡萄糖 12.5 mmol/L、10% FBS、1%双抗的DMEM培养基)，25、50、100 mmol/L共3组(含葡萄糖100 mmol/L、10% FBS、1%双抗的DMEM培养基)。将RSC96细胞以2 000个/孔的密度接种于96孔板，每组设6个复孔，培养48 h后检测细胞活力。LBP干预实验：根据上述实验的结果及LBP的干预剂量分为以下7组：正常对照组(含葡萄糖25 mmol/L)、高糖组(含葡萄糖100 mmol/L)、LBP不同剂量组(含糖100 mmol/L+LBP 100、200、400、800 μg/mL)、甘露醇高渗对照组(甘露醇75 mmol/L +葡萄糖25 mmol/L)。将RSC96 细胞以2000个/孔的密度接种于96孔板，每组设6个复孔，培养48 h后检测细胞增殖。

1.2.3 四唑盐比色法(MTT)检测细胞增殖：细胞在96孔板中培养48 h后统一吸出培养液，用PBS 100 μl清洗后，所有孔统一加入25 mmol/L葡萄糖的完全培养基100 μl；然后每孔加入50 μl MTT，放入37 ℃温箱孵育4 h后吸出上清液；每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，室温下放在摇床上震荡混匀10 min，放置于ST-360酶标仪上，在570 nm波长处测定各孔的吸光度值(Optical Density，OD)。具体操作参照试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 不同浓度葡萄糖对RSC96细胞活力的影响：与12.5 mmol/L组比较，25 mmol/L组RSC96细胞活力显著升高(P<0.05)，之后随着培养基葡萄糖浓度的升高，RSC96细胞活力逐渐下降。与25 mmol/L组比较，50 mmol/L组RSC96细胞活力显著下降(P<0.05)，100 mmol/L组RSC96细胞活力显著下降(P<0.05)。与50 mmol/L组比较，100 mmol/L组RSC96细胞活力显著下降(P<0.05)，见图1(目录后)。

2.2 不同剂量LBP对高糖诱导的RSC96细胞增殖的影响：上述实验证实培养基葡萄糖浓度为25 mmol/L时RSC96细胞活力最强，故把葡萄糖浓度25 mmol/L设为正常对照组。培养基葡萄糖浓度为100 mmol/L时RSC96细胞显著下降，故把葡萄糖浓度100 mmol/L设为高糖组。与正常对照组比较，高糖组RSC96细胞增殖能力显著下降(P<0.05)，甘露醇组差异无统计学意义(P>0.05)。与高糖组比较，予LBP处理后，细胞增殖能力逐渐增强，高糖+LBP 200 μg/mL组明显增强(P<0.05)，高糖+LBP 400 μg/mL组显著增强(P<0.05)，高糖+LBP 800 μg/mL组明显增强(P<0.05)。高糖+LBP 400 μg/mL组RSC96细胞增殖能力最强，与高糖+LBP 400 μg/mL组比较，高糖+LBP 200 μg/mL组、高糖+LBP 800 μg/mL组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2(目录后)。

3 讨论

雪旺细胞是周围神经系统的髓鞘形成细胞，对周围神经的功能维护和神经再生至关重要。研究LBP对高糖诱导雪旺细胞增殖的影响，对防治DPN也具有重要意义。本实验结果显示，25 mmol/L组RSC96细胞活力最强，100 mmol/L组RSC96细胞活力下降最为显著，这提示了葡萄糖浓度为25 mmol/L时可能使RSC96细胞增殖效果最佳，而后随着葡萄糖浓度的增加，增殖能力逐渐下降。分析原因，考虑可能是因为一定浓度的葡萄糖浓度可为雪旺细胞的增殖及生长提供必需的营养物质，而当葡萄糖浓度过高时，由于细胞内外的渗透压平衡被打破，细胞外的浓度过高，致使部分RSC96细胞存在脱水现象，不利于其增殖生长，过高的浓度甚至会导致细胞凋亡。事实上，Mahmoudzadeh等人也报道证实，雪旺细胞极易受到高血糖的损害[6]，高血糖诱导雪旺细胞损伤可能导致局部神经传导减少，轴突萎缩，影响受损轴突再生[7]。雪旺细胞的损伤是引起糖尿病周围神经病变(DPN)的机制之一，之前的研究报道DPN患者的雪旺细胞出现了凋亡[8]。高血糖产生的一些化合物，如甲基乙二醛和晚期糖基化终末产物造成雪旺细胞凋亡，导致了DPN的发生[9]。同时高血糖又加重神经纤维组织的氧化应激反应，使成熟的雪旺细胞发生脱髓鞘病变，在导致DPN的过程中起关键作用。研究证实，雪旺细胞能够为轴突迁移提供生物活性物质，释放调节轴突生长的因子[10]。此外，雪旺细胞激活损伤部位的巨噬细胞，释放细胞因子，分泌神经营养因子，指导合成再生，完成髓磷脂吞噬[11]。特别是在神经受损后，雪旺细胞通过几种生长因子和激素的表达对轴突提供营养支持[12]，包括神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)和神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)。这些神经营养因子的分泌对促进轴突生长和防止神经元启动程序性细胞死亡非常重要[13]。除了生长因子，雪旺细胞可促进轴突表面细胞黏附分子生长和基板组装，这是一个髓鞘形成的先决条件，雪旺细胞形成髓鞘保证了神经元动作电位跳跃式的快速传导。

本文在后续实验中为了探索不同剂量的LBP促进高糖诱导RSC96细胞增殖的最佳剂量，结果发现，400 μg/mL LBP促进高糖诱导的RSC96细胞增殖效果最佳。这一结果也为今后进行体内实验及在 DPN 动物模型上进行药物剂量筛选提供了数据支持。提示了应用浓度为400 μg/mL LBP能够有效地促进高糖诱导的RSC96细胞发生增殖，帮助DPN模型大鼠控制有关症状，同时也说明应用一定浓度水平的LBP可能有助于改善DPN模型的血糖水平。分析原因，主要可能与LBP的降糖作用及可保护神经轴突及髓鞘的有关超微结构有关。LBP作为我国重要中药材枸杞中的主要有效成分，其活性较高，能够较好地降低血糖和血脂，并能改善机体内的胰岛素抵抗状态。有报道指出，LBP能够强化机体中抗氧化剂的有关活性，减少氧化物形成，提升机体的抗氧化功能，同时还能减少自由基针对胰岛细胞产生的损害，促进胰岛功能逐渐恢复，明显地促使胰岛素不断分泌，最终逐步降低机体的血糖水平[14]。DPN的主要病理改变包括神经轴突的损坏，以及神经纤维产生的间断型髓鞘脱失等。LBP能够有效上调髓鞘有关蛋白如P0的表达，降低了病变神经的轴突及SCs细胞损伤，最终对髓鞘的主要形态结构产生了较好的保护效果[15]。

综上所述，LBP4 00 μg/mL对高糖诱导的RSC96细胞增殖作用最佳，能够较好地促进雪旺细胞增殖，对DPN的防治具有重要的意义。