混合性神经内分泌-非神经内分泌肿瘤的基因改变和靶向治疗的研究进展

程 浩，依荷芭丽·迟，石素胜

混合性神经内分泌-非神经内分泌肿瘤(mixed neuroendocrine-non-neuroendocrine neoplasm, MiNEN)是一种罕见肿瘤，以前被称为混合性腺神经内分泌癌(mixed adenoneuroendocrine carcinoma, MANEC)。最初于1924年由Cordier报道，根据WHO(2010)消化系统肿瘤分类，MANEC定义为包含腺癌和神经内分泌癌两种成分，每种成分至少占30%[1]；WHO(2017)分类中提出MiNEN必须至少含有30%的神经内分泌成分以及至少30%的非神经内分泌成分(可能包括腺癌或鳞状细胞癌等)[2]。笔者检索国内外文献，目前描述此类型肿瘤仍多用MANEC，尚未统一命名为MiNEN，故下文均使用MANEC。MANEC的临床和生物学特征与单纯神经内分泌癌或腺癌不同，两种成分的基因改变及与预后的关系，目前尚不十分清楚，本文总结归纳相关文献，对这类肿瘤的基因改变和治疗靶点进行综述。

1 p53基因

抑癌基因p53是肿瘤中最常见的突变基因[3]，p53基因编码一种参与细胞周期控制的蛋白质，位于17p13，该基因有DNA修复等作用，阻滞细胞周期促使有癌变倾向的细胞凋亡，Scardoni等[4]对6例MANEC的外分泌和神经内分泌成分进行基因突变评估，利用新一代测序技术对54种癌相关基因进行靶向测序，发现胃肠道MANEC两种成分具有相似的突变谱，提示两者具有共同的致癌机制，其中p53基因突变最常见，5例在两种成分中均表现重叠的突变谱(11/12，91.7%)。Milione等[5]回顾性分析160例MANEC临床病理特征，突变型MANEC中有17例发生p53突变(17/33，51.5%)。Li等[6]分析23例结直肠MANEC和文献报道的病例，发现80%以上的神经内分泌成分和腺癌成分共同出现p53和APC相同等位基因的杂合性缺失。在其他研究[7-10]中，MANEC的两种成分之间也存在相同的p53突变模式。p53基因突变导致的p53失活可以促进肿瘤的快速发展，目前人们正通过不同的策略促进突变的p53恢复正常功能，以消除肿瘤细胞，多种以p53基因为靶点的化合物正在进行临床试验[3]。APR-246能使p53恢复其野生型构象，通过诱导转录靶点激活通路，并能够在体内外对基因治疗重新敏感。此外，APR-246介导的氧化应激诱导细胞死亡[11]。Liu等[12]的研究结果表明，APR-246可上调p53靶基因，抑制肿瘤克隆，诱导p53突变的肿瘤细胞凋亡，并且APR-246能够通过p53的积累协同增强5-FU和顺铂的抑制作用，恢复对顺铂的化学敏感性。由于p53突变发生于约50%的肿瘤中，若这类靶向药物能成功应用于临床，对人类健康可能带来巨大益处。

2 KRAS基因

RAS基因家族中与人类肿瘤发生相关的基因有三种：HRAS、KRAS和NRAS，分别位于11、12和1号染色体上，这3种基因编码一系列鸟苷三磷酸(GTP)结合蛋白，这些蛋白在调节正常细胞增殖和细胞信号传导中发挥着重要的作用，其在人类20%以上的肿瘤中发挥致癌驱动作用[13]。在RAS基因中，KRAS基因对人类肿瘤影响最大，KRAS基因一旦发生突变，其就会持续刺激细胞生长，打乱生长规律，导致肿瘤发生。Karkouche等[14]的研究结果表明，在这两种肿瘤成分中，同一位点上的KRAS突变占57%。Woischke等[10]的实验观察到80%的结直肠MANEC发生KRAS突变(2个在第13外显子中，6个在第12外显子中)。其他研究[9,15]也检测到了MANEC中KRAS基因突变。EGFR信号通路参与细胞的正常生长和分裂过程，KRAS蛋白是EGFR下游信号通路中的重要分子，当KRAS基因突变时就可以脱离EGFR信号通路的调控，从而持续活化EGFR通路诱导肿瘤细胞无节制增长，所以KRAS基因的突变会影响EGFR抑制剂的效果，KRAS被认为是结直肠腺瘤靶向治疗抗EGFR单抗疗效的分子预测因子。目前临床最常用的EGFR靶向药物是小分子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)，第一代为可逆抑制剂，包括吉非替尼(易瑞沙)、厄洛替尼(特罗凯)和埃克替尼(凯美纳，国内自主研发药)等。阿法替尼(吉泰瑞)是已被批准应用于非小细胞肺癌的第二代EGFR抑制剂，其他包括来那替尼和达克替尼等，能够不可逆抑制EGFR。第三代EGFR抑制剂奥希替尼(泰瑞沙)对EGFR敏感突变和T790M耐药突变均有更好的作用，能够克服一二代EGFR-TKI引起的耐药。第四代药物正在进行Ⅰ期和Ⅱ期临床实验，目前人们正研发多靶点药物以及合理的联合用药方案，期望更加高效、安全的靶向药物。

3 BRAF基因

BRAF基因定位于染色体7q34，编码具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的RAF蛋白。RAF是EGFR信号通路中KRAS下游的重要信号分子，将信号从KRAS传导至MEK，参与激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路，即RAS-RAF-MEK-ERK/MAPK信号通路，调控细胞的生长、分化。正常情况下，RAF蛋白会依照其所接收的信号来控制下游信号通路活动，但当致病性突变发生于BRAF基因，可导致RAF蛋白处于持续激活状态，导致细胞不受控制地生长与增殖，V600E为常见的致癌性BRAF基因突变位点。Sinha等[16]分析14例MANEC全基因组拷贝数畸变，BRAF V600E阳性率为52.6%。Olofson等[17]报道1例肺腺癌合并非典型类癌，对两种组织学成分进行了新一代测序，发现两种成分均含有BRAF V600E突变。近年一些小分子BRAF抑制剂已经被开发出来，并在临床试验中显示出良好的效果，尤其是对转移性黑色素瘤。而它们在结肠癌中效果较差，如维罗非尼、达拉菲尼。然而不幸的是，大多数最初对肿瘤有反应的患者最终对BRAF抑制剂产生获得性耐药性。目前已经确定一些耐药机制，包括继发性NRAS突变和BRAF选择性剪接，导致MAPK通路的重新激活，与单用达巴非尼相比，BRAF抑制剂达巴非尼联合MEK抑制剂曲米替尼治疗转移性黑色素瘤可显著延长患者的无瘤生存期，联合治疗的BRAF抑制剂和其他药物不仅可以绕过或延迟耐药性，还可能导致较少的副作用[18]。

4 APC基因

APC基因是一种抑癌基因，定位于5q22，编码APC蛋白，APC蛋白在细胞质内与β-catenin形成复合物，导致β-catenin降解。如果缺乏APC蛋白，过多的β-catenin就会进入细胞核聚集，激活转录过程，导致细胞持续增殖形成肿瘤。Vortmeyer等[19]对7例分化较差的神经内分泌癌和腺癌构成的碰撞性肿瘤进行了研究，发现有4个等位基因杂合性缺失APC基因和p53基因。Furlan等[20]对3例结肠MANEC进行基因分析，发现在神经内分泌成分和外分泌成分中，染色体上同一等位基因杂合性缺失5q(APC，5q21)、17p(p53，17p13.2)和18q(SMASD4,18q21)。目前，研究最多的是APC参与的Wnt信号通路，证实应用各种小分子阻断Wnt途径可作为结直肠癌治疗的靶点。但APC的功能远不止Wnt途径，对非Wnt通路的研究可能是未来药物研发的方向。

5 错配修复(mismatch repair, MMR)基因与微卫星不稳定性

DNA MMR基因MSH2、MSH6、MLH1和PMS2参与DNA修复机制以保证DNA复制的准确性，若MMR基因失活并丧失修复功能，可引起DNA复制过程中错配的累积，导致微卫星不稳定的发生，间接促进肿瘤细胞增殖。微卫星又称简单重复序列或短串联重复序列，微卫星不稳定是指某一微卫星由于重复单位缺失、插入或合并，从而导致微卫星序列发生改变的现象，许多肿瘤中都存在微卫星不稳定现象。Jesinghau等[9]检查19例结直肠MANEC微卫星不稳定性和MLH-1启动子甲基化状态，发现2例(11%)表现出高微卫星不稳定性。Wang等[7]对神经内分泌成分和腺癌成分进行基因检测显示在大多数表现为相同的微卫星不稳定、杂合性缺失或p53突变(27/30)，提示它们可能来自相同的干细胞。目前，越来越多的证据表明微卫星不稳定、肿瘤突变负荷和PD-1/PD-L1表达是三种生物学标志物，每一种都与提高免疫治疗的反应率有关[21]。

6 其他基因

Woischke等[10]发现在这两种肿瘤成分的共同基因改变中出现PIK3CA突变，这种突变更多地发生在腺成分中。PI3K是PI3K/AKT1/MTOR通路中的关键激酶之一，在多种实体肿瘤的细胞生长、增殖和存活中发挥着重要作用。15%～20%的结直肠癌含有激活PIK3CA外显子9和(或)外显子20突变的基因，使PIK3CA成为结直肠癌中最常见的突变基因之一，目前新兴的靶向药物如mTOR抑制剂(依维莫司)在治疗MANEC方面具有一定的应用前景，但尚缺乏相关文献支持[22]。Nassereddine等[23]利用新一代测序技术对1例MANCE两种肿瘤成分进行基因分析，发现SMAD4存在于高水平的神经内分泌成分中。Sinha等[16]对14例MANEC和5例神经内分泌癌进行全基因组测序，发现MYC扩增(定位于8q24.21)和PTGER4扩增(定位于5p13)，PTGER4扩增的发现意味着针对前列腺素合成途径靶向治疗的可能。

另外，还有一些基因如ATM、CTNNB1、ERBB4、JAK3、KDR和RB1等是否与MANEC发生机制有关仍需探讨[24]。

综上所述，MANEC是一种罕见的肿瘤，近年发现其发病率有明显增高趋势，可能与诊断技术的进步和对该罕见肿瘤认识水平的提高有关，MANEC的两种肿瘤成分的共同基因改变中，最常发现p53、KRAS、BRAF及APC等基因突变，确定分子突变亚型选择合适的靶向治疗是治疗MANEC的关键。

虽然MANEC的发生机制[7,14,20,25,26]已经提出了一些假说，但其遗传学特征仍不清楚。因此，我们认为需要更多的研究来阐明这些肿瘤的基因改变和组织起源。在精准医学时代，破译致癌的分子途径可以指导靶向治疗和提供预后信息，所以识别相关分子改变十分重要。