高原鼢鼠肝脏组织细胞周期相关基因的进化和表达

安志芳， 魏琳娜， 王志洁， 李苏华， 徐波， 李永晓， 魏莲， 魏登邦， *

(1.青海大学省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，西宁810016； 2. 青海大学医学院，西宁810016； 3.青海大学畜牧兽医科学院，西宁810016； 4. 青海大学生态环境工程学院，西宁810016)

细胞周期是细胞生命活动的基本过程，主要分为G1、S、G2和M期(翟中和等，2000)。细胞周期的调控是通过各个时期特异的细胞周期调控因子实现的，主要包括3大类：细胞周期蛋白(cyclin)，包括CyclinA、CyclinB、CyclinD、CyclinE等；细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)，包括CDK2、CDK4、CDK6等；细胞周期依赖性激酶抑制因子(cyclin-dependent kinases inhibitor，CDKI)，包括p21、p16、p19、p27等。Cyclin是细胞周期正调控因子，CDKI是细胞周期负调控因子，CDK的活性受Cyclin正向调节，受CDKI负向调节，Cyclin会与对应的CDK结合，形成Cyclin-CDK复合物，进而决定细胞周期进程(Coatsetal.，1996；Sherr & Roberts，1999；Balter & Vogel，2001)。

研究表明，低氧诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p16、p21、p27高表达，CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK2等低表达，进而引起细胞周期G1期阻滞(Krtolicaetal.，1998；Gardneretal.，2001；Godaetal.，2003；Cazzalinietal.，2010；Hubbietal.，2013)。细胞周期G1期阻滞是机体应对外界刺激的一种保护反应，可以提供充足的时间修复受损的DNA，从而避免突变基因遗传给子代细胞，避免肿瘤的发生(Kastanetal.，1991；Cazzalinietal.，2010)。低氧诱导p53下游Gadd45α、14-3-3-σ等基因的高表达以及CyclinB1等的低表达，引起细胞周期G2期阻滞(Hermekingetal.，1997；Innocenteetal.，1999；Puccietal.，2000；Hammeretal.，2007)。细胞周期G2期阻滞可以保证细胞有丝分裂过程中遗传物质分配的忠实性，保持基因组的稳定(Kastanetal.，1991；Cazzalinietal.，2010)。

地下鼠是一类终身生活在完全封闭的地下洞道中的啮齿动物，其地下洞道严重缺氧(Nevo，1999，2011；Nevoetal.，2001)。大量研究表明，在长期的进化过程中，地下鼠形成了一系列适应低氧的策略(Arieli & Ar，1981；Fangetal.，2014；Shaoetal.，2015；Maliketal.，2016；Danial-Farranetal.，2017；Schmidtetal.，2017)。研究表明，地下鼠具有寿命长和抗肿瘤的特征，以色列鼹鼠Nannospalaxgalili和裸鼹鼠Heterocephalusglaber的寿命分别长达21年和30年，且在国外40多年的研究过程中，无论是野外采集的样本还是实验室养殖的样本，没有发现一例患有肿瘤的个体(Buffenstein & Jarvis，2002；Buffenstein，2008；Kimetal.，2011；Edreyetal.，2012；Tianetal.，2013)。研究发现，生活在湿润低氧的玄武岩地下洞道中的以色列鼹鼠肾脏组织中的p21基因表达水平显著高于生活在干旱高温的白垩土壤洞道中的个体(Zhaoetal.，2016)。Miyawaki等(2015)的研究发现，裸鼹鼠会上调p16和p19的mRNA和蛋白水平。Fang等(2014)对以色列鼹鼠基因组和转录组的研究发现，低氧上调其脑组织中p21、p16和p19基因的表达，下调CyclinD1、CyclinG1、CyclinG2和CDK2等基因的表达。因此，地下鼠通过上调细胞周期依赖性激酶抑制因子的表达、下调细胞周期蛋白等的表达诱导细胞周期G1、G2期阻滞。

Kim等(2011)对裸鼹鼠基因组的研究发现，CyclinE1在第335号位点由丙氨酸(Ala)变异为缬氨酸(Val)，该位点的变异可能与裸鼹鼠长寿抗肿瘤有关。Kim等(2011)和Miyawaki等(2015)的研究发现，裸鼹鼠中细胞周期因子p16和p19结构的变异对其功能的发挥起着重要作用。p53是一个肿瘤抑制因子，通过上调或下调其下游靶基因表达，从而调控细胞周期，进行DNA损伤修复(Agarwaletal.，1998；Vogelsteinetal.，2000)。研究发现，以色列鼹鼠中p53结构的变异对其功能的发挥有重要的作用，p53在DNA结合域172位由精氨酸(Arg)突变为赖氨酸(Lys)，这种变异使得p21基因高表达，细胞周期G1期阻滞(Ashur-Fabianetal.，2004；Avivietal.，2007)。因此，地下鼠细胞周期的调控不仅与细胞周期相关基因的表达水平有关，而且与其结构的变异有关。

高原鼢鼠Myospalaxbaileyi是生活在青藏高原2 800～4 200 m地区的一种典型的地下鼠，其洞道内氧气的含量较同地区大气中的低20%(王祖望等，1979；樊乃昌，施银柱，1982；刘仁华，1995)。目前，在低氧条件下，关于高原鼢鼠肝脏组织中细胞周期相关基因的表达水平，以及细胞周期因子是否在长期低氧的作用下为了适应低氧环境发生了结构上变异的研究鲜见报道。因此，本文应用生物信息学方法对p53下游细胞周期相关因子p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-σ、Gadd45α、B99和CyclinB1进行了进化分析，并以SD大鼠Rattusnorvegicus为对照，研究了这些基因在不同海拔(3 300 m和2 260 m)条件下高原鼢鼠肝脏组织中的表达模式。

1 材料与方法

1.1 实验动物

16只高原鼢鼠捕捉于青海省西宁市湟源区宗家沟(101°17′E，36°43′N，海拔3 300 m)，随机分为2组，每组8只。实验动物处理方法同An等(2018)的前期研究。第1组为高海拔组(海拔3 300 m)，该组为宗家沟地区(海拔3 300 m)捕捉的样本；第2组为低海拔组(海拔2 260 m)，将捕捉于宗家沟的高原鼢鼠置于西宁实验室(海拔2 260 m)饲养8 d。

16只SD大鼠购买于甘肃省兰州市[实验动物生产许可证号：SCXK(甘)2018-0002，实验动物使用许可证号：SYXK(甘)2018-0002]，随机分为 2组，每组8只。第1组为高海拔组(海拔3 300 m)，将SD大鼠置于宗家沟地区(海拔3 300 m)饲养8 d；第2组为低海拔组(海拔2 260 m)，将SD大鼠置于西宁实验室(海拔2 260 m)饲养8 d。

所有实验动物均用5%戊巴比妥钠麻醉，采集肝脏组织样品立即置于液氮中保存，采样过程中所涉及处理动物的措施均按照《实验动物管理条例(GB14923-2010)》执行。

1.2 细胞周期基因序列分析

1.2.1 序列获取从NCBI数据库下载以色列鼹鼠、大鼠、小鼠Musmusculus、橙腹草原田鼠Microtusochrogaster、金仓鼠Mesocricetusauratus、黑线仓鼠Cricetulusgriseus、突尼斯非洲跳鼠Jaculusjaculus、裸鼹鼠、达马拉鼹鼠Fukomysdamarensis、豚鼠Caviaporcellus、毛丝鼠Chinchillalanigera、智利八齿鼠Octodondegus、多纹黄鼠Ictidomystridecemlineatus、北美鼠兔Ochotonaprinceps、野兔Oryctolaguscuniculus、家牛Bostaurus、牦牛Bosgrunniens、绵羊Ovisaries、山羊Caprahircus、人Homosapiens和黑猩猩Pantroglodytes的细胞周期相关基因p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-δ、Gadd45α、B99和CyclinB1的碱基及氨基酸序列。高原鼢鼠和高原鼠兔Ochotonacurzoniae细胞周期相关基因的碱基序列利用Blast程序将实验室前期已测得的三代转录组数据库中全长非嵌合序列文件以及二代转录组数据库中的Trinity文件，构建本地Blast数据库，分别用以色列鼹鼠和北美鼠兔上述周期相关基因的编码区序列作为query文件进行Blast比对筛选，使用DNASTAR中的Lastergene程序(Burland，2000)拼接筛选出的基因片段，最终获得完整的编码区碱基序列，使用MEGA 7.0(Kumaretal.，2016)将所有比对以及拼接筛选出的序列进行比对，挑选与以色列鼹鼠和北美鼠兔同源性最高的一段序列作为目标基因的编码区序列，利用基因探索者软件将编码区序列翻译成氨基酸序列。

1.2.2 同源性分析选择与高原鼢鼠亲缘关系较近的2种地下鼠(以色列鼹鼠和裸鼹鼠)、大鼠、小鼠和人的p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-δ、Gadd45α、B99和CyclinB1基因编码区序列和氨基酸序列，用DNAMAN 9.0和MEGA 7.0进行同源性分析。

1.2.3 物种树构建方法从NCBI数据库中检索并下载1.2.1中包括高原鼢鼠和高原鼠兔在内的22个物种(啮齿目Rodentia 14个物种、兔形目Lagomorpha 3个物种、鲸偶蹄目Cetartiodactyla 3个物种和灵长目Primates 2个物种)的线粒体DNA全基因组序列，利用贝叶斯算法的MrBayes 3.2(Huelsenbeck & Ronquist 2001；Ronquist & Huelsenbeck，2003)构建贝叶斯系统进化树。采用PAUP 4.0(Swofford，2002)和Modeltest 2.3(Darribaetal.，2012)筛选最优模型，以赤池信息量准则(Alaike information criterion，AIC)(Bozdogan，1987；Brooks，1989)为标准进行最优模型的筛选与确定，采用马尔科夫链蒙特卡罗(Markov chain Monte Carlo，MCMC)运算(Gamerman & Lopes，2006)，以随机树为起始，当运行2条和4条(1条冷链和3条热链)MCMC时，分歧频率的标准差稳定到小于0.01为止。在贝叶斯系统发育树构建的过程中，共进行106代的MCMC运算，设置每100代间隔进行一次抽样，舍弃起始老化样本数(burn-in)占总数的25%(Wangetal.，2016)。利用TreeGraph 2.7.1作图(Stöver & Müller，2010)。

1.2.4 选择压力分析分别将22个物种的p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-δ、Gadd45α、B99和CyclinB1基因编码区序列用ClustalX 1.81进行比对，比对后的结果利用MEGA 7.0进行格式转换，应用PAML 4.8中的CODEML程序(Zhangetal.，2005；Yang，2007)，选用该程序中改进的基于最大似然法的分支位点模型(“test2”)对基因序列进行正向选择分析。将高原鼢鼠设为前景支，其余支系设为背景支，先用model A检测前景支中是否存在显著的正选择位点，检测标准为贝叶斯经验贝叶斯值大于0.95；再将控制文件(codeml.ctl)中的fix omega和omega值都设定为1，作为Null A进行第二次运算，提取2次运算得到的lnL值，分别记为lnL1和lnL0，计算其加倍差值2×ΔlnL。最后利用PAML 4.8中的Chi2程序，基于2×ΔlnL值计算模型的后验概率P值(df=1)，当P<0.05时，可认为此模型得到的结果较可靠。

1.2.5 趋同进化分析选用1.2.1中的22个物种，对p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-δ、Gadd45α、B99和CyclinB1基因的氨基酸序列进行地下鼠趋同进化分析。利用DNAMAN 9.0进行序列比对，使用PAML 4.8中的CODEML程序(Yang，2007)对每组蛋白序列进行了祖先序列重建。用重建后祖先位点的后验概率评估重建结果的准确性。由于祖先位点多态性会干扰后续分析，因此舍弃后验概率小于0.9的位点。应用converg 2(Zhang & Kumar，1997)检验趋同进化位点的显著性；应用MEGA 7.0中的ClustalW模式对22个物种的氨基酸序列进行比对，去掉所有空格，并按指定格式做出系统发育树，然后输入树文件和序列文件并应用Jones-Taylor-Thornton 距离矩阵模型和泊松校正模型分别计算，参数使用默认值，舍弃P>0.05的结果(Zhang & Kumar，1997)。

1.2.6 变异位点对基因功能影响的评估由于SIFT数据中与高原鼢鼠亲缘关系最接近的物种为小鼠，因此从NCBI和Ensembl数据库中下载得到小鼠p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-δ、Gadd45α、B99和CyclinB1的蛋白ID，以该氨基酸序列作为query序列，采用“Sorting Tolerant From Intolerant(SIFT)”的algorithm程序评估氨基酸变异位点对该基因功能的影响，其中参数的设置使用默认值(Kumaretal.，2009)。

1.3 高原鼢鼠细胞周期基因表达水平测定

利用总RNA抽提试剂盒(天根，中国)提取高原鼢鼠和SD大鼠肝脏组织总RNA，核酸蛋白含量检测仪测定A260/A280值(1.80.4 μg·μL-1)。取1.9 μg总RNA采用First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher Scientific Inc.，美国)试剂盒制备cDNA。高原鼢鼠和SD大鼠基因序列的同源区利用Beacon Designer 7.7设计荧光定量特异性引物，并由南京金斯瑞生物科技有限公司进行引物合成，引物序列详见表1。

表1 荧光定量引物序列Table 1 Quantitative PCR primers used in this study

2 结果

2.1 高原鼢鼠细胞周期基因同源性比对结果

同源性比对发现，高原鼢鼠细胞周期相关基因p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-σ、Gadd45α、B99和CyclinB1编码区及氨基酸序列与以色列鼹鼠同源性最高，达到90%以上(表2)。

表2 高原鼢鼠与其他物种细胞周期基因、氨基酸序列同源性比较Table 2 Gene， amino acid sequence homologies of cell cycle-related genes between Myospalax baileyi and other species

2.2 物种树的构建

根据选取的22个物种的线粒体DNA全基因组序列构建物种进化树。DAMBE饱和度检测结果显示，指标分数(index score，ISS)低于临界分数(critical score，TSS.C)(ISS=0.685，TSS.C=0.830，P<0.01)，说明核酸替换未达到饱和，适合建树。最佳DNA进化替代模型采用with gamma-distributed rate variation across sites和a proportion of invariable sites的GTR模型。所得的贝叶斯树各支的支持率都大于85%(图1)，可以用于后续研究。

图1 22种哺乳动物的mtDNA系统进化树Fig. 1 Phylogenetic tree of 22 mammal species based on mtDNA

2.3 高原鼢鼠细胞周期相关因子选择压力分析

基于图1构建的22个物种进化树，检测高原鼢鼠细胞周期相关因子p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-σ、Gadd45α、B99和CyclinB1是否具有正向选择位点。结果表明，CDK2有2个潜在的正向选择位点，分别为第330号位点的苏氨酸(Thr)和第341号位点的异亮氨酸(Ile)；B99有2个潜在的正向选择位点，为第168号位点的谷氨酰胺(Gln)和第447号位点的丝氨酸(Ser)；Gadd45α有2个潜在的正向选择位点，分别为第8号位点的丝氨酸(Ser)和第14号位点的赖氨酸(Lys)；CyclinB1有1个潜在的正向选择位点，为第396号位点的精氨酸(Arg)，但是似然比检验法显示这些位点差异不显著(2ΔlnL=0，P>0.05)(表3)。

表3 高原鼢鼠细胞周期基因选择压力似然比检验Table 3 Likelihood ratio test of branch-site models for cell cycle-related genes in Myospalax baileyi

2.4 细胞周期相关因子趋同进化分析

22个物种细胞周期相关因子p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-σ、Gadd45α、B99和CyclinB1(由于NCBI中无牦牛p21和CyclinB1基因序列，分别选用家牛对应序列：NP_001092428.1、NP_001039337.1)在地下鼠中的趋同进化分析显示，高原鼢鼠和以色列鼹鼠p21在第27号位点由谷氨酸(Glu，E)变异为丙氨酸(Ala，A)(图2：A)；CyclinD1第20、24、143和266号位点分别由苏氨酸(Thr，T)、天冬酰胺(Asn，N)、亮氨酸(Leu，L)和亮氨酸(Leu，L)变异为丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、异亮氨酸(Ile，I)和谷氨酰胺(Gln，Q)(图2：B)；CyclinE第86、92、125、126和402号位点分别由亮氨酸(Leu，L)、苏氨酸(Thr，T)、谷氨酸(Glu，E)、赖氨酸(Lys，K)和赖氨酸(Lys，K)变异为缬氨酸(Val，V)、赖氨酸(Lys，K)、天冬氨酸(Asp，D)、天冬酰胺(Asn，N)和谷氨酰胺(Gln，Q)(图2：C)；CyclinB1第105、135和370号位点分别由缬氨酸(Val，V)、谷氨酸(Glu，E)和丝氨酸(Ser，S)变异为天冬酰胺(Asn，N)、天冬氨酸(Asp，D)和半胱氨酸(Cys，C)(图2：D)，而CDK6、CDK2、14-3-3-σ、Gadd45α和B99在高原鼢鼠和以色列鼹鼠中没有趋同进化位点。

图2 最大似然法构建的p21(A)、CyclinD1(B)、CyclinE(C)和CyclinB1(D)系统发育树和进化位点Fig. 2 Maximum-likelihood tree of the p21(A)， CyclinD1(B)， CyclinE(C) and CyclinB1(D) gene sequences and the convergent sites

系统发育树后的序列分别表示氨基酸和对应的碱基序列， 加粗及下划线的氨基酸表示高原鼢鼠和以色列鼹鼠共有的趋同进化位点

Amino acids and codons of convergent sites are shown in the right part of each panel， and amino acids inMyospalaxbaileyiandNannospalaxgaliliare highlighted in bold and underline

2.5 高原鼢鼠细胞周期相关因子变异位点对其功能影响的评估

SIFT评估结果表明，高原鼢鼠与以色列鼹鼠细胞周期相关因子的趋同进化位点中，只有p21第27号位点丙氨酸(Ala，A)和CyclinB1第105号位点天冬酰胺(Asn，N)的变异对其功能有显著影响，其余变异位点对基因功能均没有影响(表4)。

表4 高原鼢鼠细胞周期基因氨基酸序列中 突变位点对其功能的影响Table 4 The effects of mutation sites on the function of cell cycle-related genes in Myospalax baileyi

2.6 高原鼢鼠和SD大鼠细胞周期基因mRNA表达水平

荧光定量PCR结果表明，与低海拔条件(2 260 m)相比，在高海拔条件(3 300 m)下，高原鼢鼠肝脏组织中细胞周期基因p21的表达水平极显著高于低海拔(2 260 m)下的表达水平(P<0.01)，p21下游基因CyclinD1、CDK6、CyclinE和CDK2的表达水平显著低于低海拔(2 260 m)下的表达水平(P<0.05)，而在SD大鼠肝脏组织中上述基因的表达水平差异都没有统计学意义(P>0.05)。高原鼢鼠和SD大鼠肝脏组织中细胞周期基因14-3-3-δ、Gadd45α、B99和CyclinB1表达水平间的差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。在不同海拔条件下，高原鼢鼠肝脏组织中细胞周期相关基因p21、CyclinD1、CDK6、CyclinE、CDK2、14-3-3-σ、Gadd45α、B99和CyclinB1的表达水平均极显著高于SD大鼠(P<0.01)(图3)。

3 讨论

G1期是细胞周期的第一阶段，在这时期细胞开始合成生长所需的RNA、蛋白质、糖类、脂质等，同时细胞体积显著增大，属于细胞的生长期(翟中和等，2000)。研究表明，低氧诱导细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p16、p21、p27高表达，CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK2等低表达，进而引起细胞周期G1期阻滞(Krtolicaetal.，1998；Gardneretal.，2001；Godaetal.，2003；Cazzalinietal.，2010；Hubbietal.，2013)。细胞周期G1期阻滞是机体应对外界刺激的一种保护反应，可以提供充足的时间修复受损的DNA，从而避免突变基因遗传给子代细胞，避免肿瘤的发生(Kastanetal.，1991；Cazzalinietal.，2010)。研究表明，p21基因的高表达是引起细胞周期G1期阻滞的直接原因(Cazzalinietal.，2010)。p21作为细胞周期负调控因子，在其N端第21～26位及第49～72位的氨基酸分别与细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶结合，抑制Cyclin-CDK复合物的活性，进而引起视网膜母细胞瘤蛋白不能发生磷酸化，阻止转录因子E2F的释放，使得参与细胞周期的CyclinD1、CyclinE等不能表达，阻止细胞从G1期进入S期，导致细胞周期G1期阻滞(Sherr & Roberts，1995，1999；Gartel & Radhakrishnan，2005)。本研究结果表明，在高原鼢鼠肝脏组织中，与G1期调控相关的基因p21表达水平随海拔的升高显著升高，p21下游基因CyclinD1、CyclinE、CDK6和CDK2的表达水平随海拔的升高显著降低，而在SD大鼠中没有差异；在高原鼢鼠和SD大鼠肝脏组织中，与G2期调控相关的基因Gadd45α、B99、14-3-3-δ和CyclinB1的表达水平随海拔改变不发生变化。因此，高原鼢鼠通过长期的低氧适应，在高海拔条件下，p21基因的高表达抑制了下游CyclinD1、CyclinE、CDK6和CDK2基因的表达，从而诱导细胞周期G1期阻滞，提供了充足的时间修复受损的DNA，保证了DNA复制的准确性。

图3 高原鼢鼠和SD大鼠肝脏组织中细胞周期基因在不同海拔条件下的mRNA表达水平
Fig. 3 Quantification of the mRNA levels of cell cycle-related genes in the liver ofMyospalaxbaileyiandRattusnorvegicusunder different altitudes

*P<0.05，**P<0.01， ns.P>0.05

细胞周期调控不仅与细胞周期相关基因的表达水平有关，而且与其结构的突变有关。p21是细胞周期负调控因子，主要有2个功能结构域，N端第21～26位及第49～72位的氨基酸分别与Cyclin和CDK结合，抑制Cyclin-CDK复合物的活性；C端第124～164位氨基酸与增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)结合，使得PCNA不能与DNA聚合酶δ结合，抑制DNA的复制(Luoetal.，1995；Johnson & Walker，1999)。研究发现，p21第31号位点由极性不带电的丝氨酸(Ser)变异为极性带正电的精氨酸(Arg)，这会使得p21蛋白结构发生变化，该位点的变异与乳腺癌、宫颈癌等的易感性有关(Lukasetal.，1997)。在人类乳腺癌中，p21第94号位点由极性带正电的精氨酸(Arg)变异为非极性的色氨酸(Trp)，该位点的变异使得p21抑制CDK的能力减弱，但是与PCNA结合的能力没有发生改变(Balbínetal.，1996)。本研究的SIFT评估结果表明，高原鼢鼠p21第27号位点的变异对其功能有显著影响，该位点由极性带负电的谷氨酸(Glu)变异为非极性的丙氨酸(Ala)，位于Cyclin结合域附近，其改变了该区域原本带负电的局部环境，可能引起p21对Cyclin和CDK的结合力增强，从而使得p21阻滞细胞周期的功能增强。

CyclinB1属于细胞周期蛋白，在其第201～288位有一个高度保守的细胞周期蛋白盒序列，该结构域与CDK1氨基末端的PSTAIR结构形成CyclinB1-CDK1复合物，该复合物被称为有丝分裂促进因子；CyclinB1位于第42～50位的氨基酸序列为降解盒结构，参与细胞周期蛋白的自身降解(Glotzeretal.，1991；Nobleetal.，1997)；此外，CyclinB1还有2个控制CyclinB1-CDK1复合物胞质-核穿梭的结构域，分别是位于第155～170位的核定位区域(nuclear localization signal，NLS)和N端第78～127位的胞质滞留结构域(cytoplasmic retention signal，CRS)，NLS结构域的作用是将CyclinB1-CDK1复合物运送至细胞核内，CRS结构域是确保有丝分裂前CyclinB1-CDK1复合物在细胞质中的定位(Robbinsetal.，1991；Pines & Hunter，1994)。研究表明，位于CRS结构域中丝氨酸(Ser)磷酸化位点突变为丙氨酸(Ala)时，CyclinB1活性消失，而当突变为谷氨酸(Glu)时，可以增强其活性(Lietal.，1997)。SIFT评估结果表明，高原鼢鼠CyclinB1位于CRS结构域中的第105号位点的变异对其功能有显著影响，该位点由非极性的缬氨酸(Val)变异为极性的天冬酰胺(Asn)，这种变异可能会导致该点附近的静电势能发生变化，影响CyclinB1-CDK1复合物从细胞核运往细胞质，从而增强细胞周期阻滞作用。

综上所述，高原鼢鼠经过长期的低氧适应，通过上调p21基因的表达抑制下游CyclinD1、CyclinE、CDK6和CDK2基因的表达，导致细胞周期G1期阻滞，从而提供充足的时间修复受损的DNA，保证了DNA复制的准确性；同时高原鼢鼠肝脏组织中细胞周期的调控不仅与细胞周期基因的表达水平有关，而且可能与细胞周期因子p21的第27号位点和CyclinB1的第105号位点的变异有关。