过氧乙酸戊二醛复方消毒剂对蜡样杆菌芽孢杀菌效果评估

弥成龙，郭 亮，郑明学，白 瑞，史晨婕，张 黎，郑龙龙，郝飞飞，冯玉萍，康慧鑫，张雪松

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

蜡样杆菌是与炭疽杆菌密切相关的细菌，对人和动物具有致病性[6]。芽孢是某些细菌在一定条件下，胞质脱水在菌体内形成具有多层膜包囊的圆形或卵圆形小体，是细菌避开不良环境、维持细菌生存处于代谢相对静止的休眠体。蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）属芽孢杆菌属（Bacillus），为需氧芽孢杆菌，俗称蜡样杆菌，广泛分布于自然界，易污染食品[7]。

山西农业大学动物科技学院兽医病理实验室复方消毒剂试验组研制的过氧乙酸戊二醛复方消毒剂（专利申请号码：CN200910263970.X）可对多种细菌繁殖体、枯草杆菌芽胞、真菌、NDV和IBDV等具有良好的杀灭效果[8-10]，且具有作用迅速、长效、抗干扰能力强且低成本和作用效率高等特点。但复方消毒剂对蜡样杆菌芽孢的杀灭效果如何，以及与复方消毒剂中含量相同的过氧乙酸、戊二醛和过氧化氢分别对蜡样杆菌芽孢的杀灭效果如何，目前还不清楚。

本试验通过复方消毒剂及其与过氧乙酸、戊二醛和过氧化氢对蜡样杆菌芽孢的杀灭效果比较，旨在为该复方消毒剂的临床应用奠定理论基础性数据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株 蜡样杆菌8008为国家消毒试验标准菌株，购自中国微生物菌种保藏中心。

1.1.2 试剂和培养基 30%过氧乙酸（广东省西陇科技有限公司）；15%过氧化氢（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；50%戊二醛（国药集团化学试剂有限公司）。过氧乙酸戊二醛复方消毒剂由山西农业大学兽医病理实验室提供。普通营养肉汤培养基（上海博微生物科技有限公司）；普通营养琼脂培养基（上海宾穗生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 复方消毒剂对蜡样杆菌芽孢定性灭菌试验

于山西农业大学兽医病理实验室进行定性灭菌试验。具体方法为：试验前将蜡样杆菌芽孢制备成悬液并活菌计数，用含1%蛋白胨的0.03 mol/L磷酸盐缓冲液将菌液稀释成为5×105～5×106cfu/mL。将复方消毒剂、与复方消毒剂中相同含量的过氧乙酸、过氧化氢、戊二醛和0.03 mol/L磷酸盐缓冲液分别以灭菌蒸馏水连续倍比稀释10次，并分别取2.5 mL细菌悬液，混匀后立即计时，分别作用 5、10、15、30、60min后，各取0.5mL菌药混合液加入到4.5mL相应的中和剂中，中和10 min后，立即取0.5 mL菌药中和剂混合液加入至4.5 mL营养肉汤培养基中，取同批试验未使用完的营养肉汤培养基作为阴性对照组，将上述0.03 mol/L磷酸盐缓冲液试验组作为阳性对照。

37℃恒温培养箱内培养至第7 d，观察试管中的营养肉汤培养基是否浑浊。若不浑浊，则说明消毒剂可以杀灭细菌芽孢；若浑浊，则说明不能杀灭细菌芽孢。定性灭菌试验共重复3次，以无菌生长的最大稀释倍数作为该消毒剂的最低有效杀菌浓度，最短作用时间为该浓度杀菌最快有效时间。

1.2.2 复方消毒剂对蜡样杆菌芽孢定量杀灭试验

a)如果Label[j]>0且medarray[Label(j)]<1，则表示该标号的块连通域首次被扫描到，则Label_index=Label_index+1；medarray[Label(j)]=Label_index；Label[j]=Label_index。

试验前用1%蛋白胨的0.03 mol/L磷酸盐缓冲液将蜡样杆菌芽孢悬液稀释成5×106～5×107cfu/mL。取5个试管分别加入0.5 mL细菌悬液、0.5 mL浓度为0.03 g/mL的牛血清白蛋白、4.0 mL相应浓度的复方消毒剂（依据定性灭菌试验确定的最低有效杀菌浓度），并设置一个4.0 mL的无菌蒸馏水作为阳性对照组，混匀后将5个试管同时放置在25℃水浴中，作用到定性灭菌试验中确定的最快杀菌有效时间时，取菌药混合液0.5 mL加入到4.5 mL相应中和剂中，中和作用10 min后取1.0 mL菌药中和剂混合液到无菌培养皿中做细菌倾注培养，于37℃恒温培养箱内培养72 h后活菌计数并计算杀菌率和杀灭对数值。

根据下列公式，计算杀菌率和杀灭对数值，阳性对照组所得结果代表菌液原浓度，以其作为计算杀菌率和杀灭对数值的初始值。杀菌率≥99.9%时，达到消毒效能，杀菌率为100%时，达到杀菌效能；杀灭对数值均≥5.00时，为消毒合格[11-12]。

式中，n0和nt分别为阳性对照组平均活菌数和试验组平均活菌数；N0和Nx分别为对照组平均活菌浓度的对数值和试验组活菌浓度对数值。

2 结果与分析

2.1 消毒剂定性杀灭蜡样杆菌芽孢试验

复方消毒剂、过氧乙酸、过氧化氢对蜡样杆菌芽孢的最低有效杀菌浓度分别为3.125%、0.125%、0.600%，该浓度下的最快有效杀菌时间依次为5、5、15 min。复方消毒剂所含戊二醛对蜡样杆菌芽孢不能完全杀灭。

2.2 消毒剂定量杀灭蜡样杆菌芽孢试验

复方消毒剂最低有效杀菌浓度（3.125%）作用5 min可有效杀灭蜡样杆菌芽孢，杀灭对数值≥5。复方消毒剂含量相同的单一成分的过氧乙酸、过氧化氢分别作用5、15 min可有效杀灭蜡样杆菌芽孢，杀灭对数值均≥5，但戊二醛（0.06%）在60 min内则无法完全杀灭蜡样杆菌芽孢，其杀灭对数值为4.08（表 1、2）。

表1 复方消毒剂定量杀灭蜡样杆菌芽孢的杀灭率 %

表2 复方消毒剂定量杀灭蜡样杆菌芽孢的杀灭对数值

3 结论与讨论

饲养健康动物、提供安全健康的动物产品和获取最佳的经济效益是现代养殖业的三大任务，而建立有效的消毒防疫体系至关重要，一个符合当地实际的消毒方案，是现代养殖企业控制疾病、获取最佳效益的重要措施。

复方消毒剂对蜡样杆菌芽孢具有良好的杀灭作用，3.125%（32倍稀释）作用5 min就可杀灭100%的蜡样杆菌芽孢，与该复方消毒剂含量相同的单一成分除戊二醛外，过氧乙酸（0.125%）作用5 min和过氧化氢（0.6%）作用15 min可有效杀灭蜡样杆菌芽孢。

过氧乙酸和过氧化氢作为强氧化剂，戊二醛作为蛋白质凝固剂，3种消毒剂不但可以高效杀毒灭菌而且互相存在协同作用[11]；且氧化类消毒剂作用强，杀毒灭菌迅速，同时过氧化氢与过氧乙酸分解产物乙酸再次生成过氧乙酸，增加其杀菌效果[2]。

吕凤霞等[13]研究表明，1.08%的H2O2作用蜡样杆菌芽孢60 min，杀灭对数值≥5.00；莫金观等[14]研究表明，1.0%和1.5%的H2O2分别作用蜡样芽孢杆菌1.5 min，杀灭对数值分别为2.12和2.86，用1.5%和2.0%的CH3COOOH分别作用蜡样芽孢杆菌1.5 min，杀灭对数值分别为3.10和≥5.00；李月丹等[15]研究表明，2%的戊二醛对蜡样杆菌芽孢没有杀灭效果。本试验得出的结果与之相似。在本试验中，0.6%的H2O2和0.125%的CH3COOOH分别作用蜡样杆菌芽孢5、15min，杀灭对数值均≥5.00，0.06%的戊二醛作用蜡样杆菌芽孢60 min，杀灭对数值为4.08。表明H2O2和CH3COOOH在一定浓度下对蜡样杆菌芽孢均有一定的杀菌效果。

洪令瑶等[16]研究表明，用0.0025%的CH3COOOH和0.002 5%的H2O2混合配制成的复方消毒液对蜡样芽孢杆菌分别作用10、480 min，其杀菌率分别为96.71%、97.08%；本研究中3.125%的过氧乙酸戊二醛复方消毒剂作用蜡样杆菌芽孢5min，杀菌率可达100%。本试验结果与之相比，消毒效果更好，消毒更彻底，更适合养殖场的实际生产与实践，且复方消毒剂的消毒效果优于单一消毒剂的消毒效果。过氧乙酸戊二醛复方消毒剂降低了使用剂量，对人畜的毒性、刺激性大大降低，更适合用于生产实践。