冠心病患者肠道菌群变化的研究

李翔 袁宇

肠道菌群按“门”“纲”“目”“科”“属”“种”分类，目前冠心病与肠道菌群失调的研究大多聚焦于肠道菌群“属”的分类。本研究从肠道菌群“门”“纲”“目”“科”“属”“种”不同分类的角度试图探寻冠心病患者与健康人群肠道菌群变化的特点，旨在探讨冠心病与肠道菌群失调的关系，现将研究结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2016 年7 月至2017 年6 月新乡医学院第一附属医院心血管内科及重症心脏监护室收治的经心电图、心肌酶学标志物、冠状动脉造影检查并结合临床表现初次确诊冠心病的住院患者86例，其中男41 例，女45 例，年龄29～75（54.67±9.45）岁。选取同期于我院体检中心检查结果为正常的健康者86 例作为对照组，其中男41 例，女45 例，年龄30～75（54.42±9.21）岁。排除既往胃肠道手术史或器质性疾病史，酗酒史、糖尿病及其他影响肠道菌群的疾病，全身或局部未控制的炎症，服用抗血小板、他汀等可能影响肠道菌群的药物，行冠状动脉支架植入术或冠状动脉搭桥术的患者。两组对象性别、年龄、血脂、身高、体重、体重指数（BMI）、空腹血糖、饮食情况比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经过医院伦理委员会批准，所有研究对象均自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 冠状动脉造影及Gensini 评分 所有冠心病组患者采用美国GE 公司Advantx LCV+数字减影血管造影系统行冠状动脉造影，有2 位经验丰富的心脏介入医师对冠状动脉狭窄程度进行判定，以至少一个冠状动脉狭窄≥50%作为冠心病的诊断标准。本实验冠状动脉狭窄程度的评价采用Gensini评分系统进行评定：狭窄程度＜25%计1 分，25%～49%计2 分，50%～74%计4 分，75%～89%计8 分，90%～99%计16 分，100%计32 分；根据冠状动脉病变的位置确定系数：左主干病变×5；左前降支病变：近段×2.5，中段×1.5，远段×1；对角支病变：D1×1，D2×0.5；左旋支病变：近段×2.5，钝缘支×1，远段×1，后降支×1，后侧支×0.5；右冠状动脉病变：近、中、远和后降支均×1。总分为冠状动脉狭窄系数×病变血管狭窄积分之和。根据Gensini 评分标准将冠心病组患者分为轻度亚组（＜40 分）40 例，中重度亚组（≥40 分）46 例。

1.2.2 相关指标的检测 对照组于体检当天，冠心病组患者于入院次日清晨空腹抽取肘静脉血送至检验科测定血压、血同型半胱氨酸（Hcy）、叶酸、维生素B12、血红蛋白、红细胞压积（Hct）水平。

1.2.3 肠道菌群的检测 收集两组受试者的粪便标本，采集受试者的新鲜粪便约5.0g 于无菌冷冻试管中，封口后于1h 内送至心脏病重点实验室中，称取2.00g 粪便，余置于-80℃超低温冰箱内保存。提取样本总DNA（按照宝生物粪便DNA 提取方法提取），用5%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA 的基因组完整性。之后所有样本的16S rDNA 的V3 区的送至苏州GENEWIZ 股份有限公司进行高通量测序。测序文库构建及Illumina Miseq 平台高通量测序由苏州GENEWIZ 股份有限公司进行。对原始数据进行去接头和低质量过滤处理，得到有效序列后聚类分析（每一个聚类称为一个物种操作单元OUT），然后作分类学分析，得到各样本物种分类信息。基于OUT 分析结果，得到各样本物种丰度和均匀度信息等；基于分类学等信息，可以在“门”“纲”“目”“科”“属”“种”分类水平上进行群落结构的统计分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS22.0 统计软件，符合正态分布的计量资料以表示，两组比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血压、Hcy、叶酸、维生素B12、血红蛋白、Hct 水平的比较 见表1。

由表1 可见，与对照组比较，冠心病组患者收缩压、舒张压、Hcy 水平较高，叶酸、维生素B12、血红蛋白、Hct 水平下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与冠心病轻度亚组比较，中重度亚组的收缩压、舒张压、Hcy 水平较高，叶酸、维生素B12、血红蛋白、Hct 水平下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.2 两组肠道菌群在门水平上的比较 见表2。

由表2 可见，在门水平上，冠心病组及对照组中拟杆菌门、厚壁菌门丰度占比明显高于其余菌门。与对照组比较，冠心病组肠道微生物菌群中拟杆菌门丰度明显下降，厚壁菌门丰度明显升高，两组5 种主要菌门比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与轻度亚组比较，中重度亚组中拟杆菌门丰度明显下降，厚壁菌门丰度明显升高，两亚组5 种主要菌门比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。观察组肠道菌群在门水平上的丰度比较见插页图1。

表1 两组血压、Hcy、叶酸、维生素B12、血红蛋白、Hct 水平的比较

表2 两组对象肠道菌群在门水平上的比较（%）

2.3 两组肠道菌群在纲水平上的比较 见表3。

由表3 可见，在纲水平上，冠心病组及对照组中拟杆菌纲、梭菌纲、Negativicutes 纲的丰度占比明显高于其余菌纲。与对照组比较，冠心病组肠道微生物菌群中拟杆菌纲丰度明显下降，梭菌纲丰度明显升高，Negativicutes 纲丰度下降，5 种主要菌纲比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与轻度亚组比较，中重度亚组拟杆菌纲丰度明显下降，梭菌纲丰度明显增高，Negativicutes 纲丰度下降，两亚组5种主要菌纲比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。观察对象肠道菌群在纲水平上的丰度比较见插页图2。

2.4 两组肠道菌群在目水平上的比较 见表4。

由表4 可见，在目水平上，两组拟杆菌目、梭菌目、月形单胞菌目的丰度明显高于其余菌目。与对照组比较，冠心病组肠道微生物菌群中拟杆菌目丰度明显下降，梭菌目丰度明显升高，月牙单胞菌目丰度降低，5 种主要菌目比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与轻度亚组比较，中重度亚组拟杆菌目丰度明显下降，梭菌目丰度明显增高，5 种主要菌目比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。观察对象肠道菌群在目水平上的丰度比较见插页图3。

2.5 两组肠道菌群在科水平上的比较 见表5。

由表5 可见，在科水平上，拟杆菌科、瘤胃菌科、毛螺菌科、韦永球菌科的丰度较高。与对照组比较，冠心病组肠道微生物菌群中拟杆菌科丰度明显下降，瘤胃菌科丰度明显升高，毛螺菌科丰度增高，5 种主要菌科比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与轻度亚组比较，中重度亚组拟杆菌科丰度明显下降，瘤胃菌科丰度明显增高，5 种主要菌科比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。观察对象肠道菌群在科水平上的丰度比较见插页图4。

表3 两组肠道菌群在纲水平上的比较（%）

表4 两组肠道菌群在目水平上的比较（%）

2.6 两组肠道菌群在属水平上的比较 见表6。

由表6 可见，拟杆菌属的丰度明显高于其余菌属。与对照组比较，冠心病组肠道微生物菌群中拟杆菌属丰度明显下降，5 种主要菌属比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。与轻度亚组比较，中重度亚组拟杆菌属丰度明显下降，两亚组5 种主要菌属比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。观察对象肠道菌群在属水平上的丰度比较见插页图5。

2.7 两组肠道菌群在种水平上的比较 因未分类组占比明显偏高，无比较意义，故不再进行比较。具体柱状图见插页图6。

3 讨论

目前冠心病在我国的发病率及死亡率仍呈逐年上升的趋势，并且预计10 年内冠心病患者数仍将快速增长[1]。因Gensini 评分高预示着更大的斑块负荷，斑块坏死组织的比率更高，斑块纤维组织的比率更低，故可以用Gensini 评分来预测冠状动脉斑块负荷和成分[2]。通过控制或减少冠心病的危险因素可以使冠心病的发病率和死亡率降低。除了血脂、炎症、高血压、糖尿病等传统危险因素，肠道菌群失调为近年来新发现的冠心病的危险因素之一[3]。

肠道菌群与许多常见的疾病有关，改变人体肠道菌群的多样性会影响人体健康。Wang 等[4]报道，胆碱、三甲胺氧化物和甜菜碱是脂质肠道菌群的代谢产物，其可以促进动脉粥样硬化，使冠心病的发病率增加。有研究人员给小鼠喂食富含三甲胺氧化物的饮食16 周，检测发现不仅动脉粥样硬化前清除受体分化抗原36（CD36）的表达增高，而且清道夫受体A（SRA）的表达也增高，这意味着胆固醇被清除减少，堆积增多，动脉粥样硬化病变面积扩大[5]。CYP7A1 是合成胆汁酸的主要酶。CYP7A1 表达增多可扩大胆汁酸池，增加胆固醇转运，减少动脉粥样斑块形成。三甲胺氧化物可以降低CYP7A1 的表达，从而抑制胆固醇的转运，导致细胞中胆固醇的积聚，从而成为动脉粥样硬化的危险因素[6]。有研究发现冠心病患者三甲胺氧化物高水平者较低水平者3 年内发生心肌梗死等不良心血管事件风险明显增加。

除了肠道菌群的丰度改变，肠道菌群的多样性也被人关注。诺丁汉大学等机构的研究人员评估了来自TwinsUK 队列的具有血清代谢组学数据的617例中年女性的颈动脉-股动脉脉搏波速度与肠道微生物组成成分之间的相关性。结果表明，女性肠道菌群多样性与动脉硬化程度呈负相关[7]。

表5 两组肠道菌群在科水平上的比较（%）

表6 两组肠道菌群在属水平上的比较（%）

肥胖是冠心病的危险因素之一，研究表明降低肥胖患者体内某种肠道菌群的丰度，可以使该患者的体重明显下降，并且将该细菌移植到无菌动物体内，也使该动物的体重明显增加[8]。上海交通大学王卫庆教授首次发现多形拟杆菌可以抑制肥胖，并对我国肥胖人群肠道菌群组成进行了研究[9]，为今后我国减肥药物的开发开辟了一条新途径。如果能成功，必将减少肥胖人群的数量，进而降低冠心病的发病率。

以色列的研究人员发现除了5.3%～8.8%的肠道菌群是可遗传的，某些细菌比其他细菌更可能传给下一代，其余大部分肠道菌群受饮食和生活方式等其他环境因素的影响，拟杆菌属的肠道菌群大多是受环境影响的，这就意味着人体内拟杆菌群的丰度是可以被干预和改变的[10]。美国斯坦福大学医学院Justin Sonnenburg 博士将一种拟杆菌（这种细菌可以消化在海藻中发现的一种称为紫菜多糖的碳水化合物）移植到小鼠体内，结果显示，饲喂不同量的海藻可有效控制动物肠道菌群的水平，这些水平可通过简单地增加或减少富含紫菜多糖的食物量来校正。然后研究人员从能够有效消化紫菜聚糖的细菌中提取基因，将它们移植到另一组没有消化能力的同类型细菌中。在随后的实验中，这种经过改造后的细菌也能起到有效控制肠道细菌的作用[11]。高血压和Hcy 与冠心病的发病率呈正相关[12]。研究表明，肠道菌群参与叶酸和维生素B12的合成[13-14]。本研究结果显示，与对照组比较，冠心病组血压和Hcy 水平升高，叶酸和维生素B12、血红蛋白、Hct 水平降低，差异有统计学意义。中重度亚组冠状动脉狭窄的患者，血Hcy、血压水平升高更显著，叶酸、维生素B12、血红蛋白、Hct 水平下降更显著。在本次研究结果中，冠心病患者与对照组的肠道菌群结构在门、纲、目、科、属的分类中均发生了明显的改变。拟杆菌在门、纲、目、科、属的分类中所占丰度比例均明显高于其他菌群，并且均呈现出与对照组比较，冠心病患者的拟杆菌群丰度明显降低的结果。与轻度亚组冠心病组比较，中重度亚组冠心病组的拟杆菌丰度明显低于轻度亚组。这表明冠心病患者中拟杆菌的丰度明显低于对照组，与冠心病轻度亚组比较，冠心病中重度亚组的拟杆菌群丰度明显降低。这提示我们通过干预肠道菌群中拟杆菌的丰度，可能会改变冠心病患者的冠状动脉狭窄情况，或者可能减少冠状动脉缺血事件的发生率。

本研究由于样本量较小，系单中心局部地区研究，缺乏多中心随机对照双盲联合研究。目前干预肠道菌群的方法有：菌群移植、抗菌素干预、饮食控制等。菌群移植目前不容易被民众所接受且安全性有待进一步研究，抗菌素干预有可能产生超级耐药菌，两种方法都有各自的较大缺陷。结合以色列研究人员的结论，即拟杆菌属的肠道菌群大多是受环境影响的，以及美国研究人员提出的动物体内肠道菌群水平可通过喂食不同数量的海草进行有效控制。因此，下一步笔者准备设计实验，让冠心病患者食用特定的海苔，观察其肠道菌群中拟杆菌的丰度的变化以及冠状动脉缺血事件发生率的改变。我国自古以来就有通过调节饮食来治疗疾病的传统，这为肠道菌群的研究提供了依据，或许可通过饮食疗法配合现代治疗方案为广大冠心病患者进一步减轻痛苦和负担。