自噬相关基因ATG4A rs807185位点单核苷酸多态性与重庆地区人群肺癌的相关性研究*

陈 姝，贺 巧，胡 琴，陈维贤，胡 锐

1.重庆医科大学附属第二医院检验科，重庆 400010；2.重庆市中医骨科医院检验科，重庆 400012

肺癌是中国癌症人群死亡的主要原因，其致病因素包括重金属中毒、吸烟、遗传和其他环境因素。越来越多的证据表明，遗传多态性与肺癌的易感性有关[1]。

细胞自噬是一个高度保守的过程，对维持细胞内环境平衡至关重要，与人类许多疾病相关。自噬相关基因(ATGs)是调节自噬通路的基因，迄今已发现超过30种ATGs。ATG4基因编码的蛋白酶在解偶联复合物ATG8-PE和促进自噬体成熟方面有着重要的作用[2]。据报道，ATG4A是乳腺癌细胞致瘤性所必需[3]，对卵巢癌的预后判断也有重要意义[4]。然而，ATG4A在肺癌的作用仍不清楚。本文拟通过病例对照研究，探讨ATG4A基因单核苷酸多态性(SNP)和肺癌风险的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2012年10月至2013年9月在重庆医科大学附属第二医院就诊的225例肺癌患者作为病例组，其中男180例，女45例；平均年龄(62.8±9.6)岁；36例患者接受过手术切除，189例患者接受过纤维支气管镜活检，这些患者均按照临床标准、放射学和组织病理学报告确诊为肺癌；腺癌81例，鳞状细胞癌89例，小细胞肺癌22例，其他非鳞状细胞癌33例。对照组选择重庆医科大学附属第二医院体检中心同时段内的健康体检者，共257例，其中男203例、女54例，平均年龄(61.7±8.5)岁，性别与年龄分布与病例组相仿，排除恶性肿瘤患者或有任何其他严重慢性疾病病史者。所有受试对象均自愿参与本研究，并签署了知情同意书。本研究经重庆医科大学附属第二医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1DNA提取 每例受试者抽取2 mL静脉血，采用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝，离心后将上层血浆与下层中上部分血细胞分装，-80 ℃冰箱保存。用天根血液基因组DNA提取试剂盒提取外周血基因组DNA，即蛋白酶K消化-饱和氯化钠盐析法。并采用紫外分光光度仪测量提取出的DNA浓度及260 nm处吸光度(A值)与A280比值，若DNA A260/A280比值在1.7～2.0则为标本纯度合格，低于1.8则考虑可能为蛋白污染，高于2.0可能存在RNA污染，不合格标本须重新抽提DNA。合格标本稀释至工作浓度后存于-80 ℃冰箱备用。

1.2.2聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP) 采用PCR-RFLP进行基因组分型[5]。PCR扩增引物为5′-GAGCAGTGCTGTCCAGTAGAA-3′和5′-GGGGGAAATGATCTCTCTCTG-3′，扩增产物为222 bp。该片段含有Alu Ⅰ酶切位点，取产物4 μL,采用限制性内切酶AluⅠ(酶切序列为5′-AGCT-3′)针对rs807185位点进行酶切，在A等位基因存在情况下，产物可被消化成88 bp和134 bp，而具有T等位基因的产物不能被消化。为进一步确认基因型，选择对照组和病例组中不同基因型别的PCR扩增产物送至上海生工公司测序，分析测序结果并与酶切分型结果进行比对，以确认酶切分型结果准确性。

2 结 果

2.1病例组和对照组的临床特征 如表1所示，病例组男女比为80∶20，对照组男女比为79∶21，两组之间在性别上差异无统计学意义(P=0.822)；纳入研究的两组研究对象均以年龄超过55岁的人群为主，约占80%，两组之间年龄差异无统计学意义(P=0.169)。病例组中吸烟者的比例较对照组高，分别为70.2%和41.2%，差异有统计学意义(P<0.001)。病例组中有肿瘤家族史的比例较对照组高，分别为13.3%和7.0%。

表1 病例组与对照组肺癌的临床特征

注：a小细胞肺癌和Ⅰ～ⅢB期非鳞状细胞癌；b小细胞肺癌和Ⅳ期非鳞状细胞癌。

2.2ATG4A rs807185多态性与肺癌的相关性

2.2.1ATG4A rs807185位点的基因型分析及测序结果 纯合突变基因型(AA)PCR产物可被切割为88 bp和134 bp两个片段，野生基因型(TT)不能被切开，仍然为222 bp的一个片段，而杂合突变基因型(AT)则被部分切开，出现88、134 bp和222 bp 3个片段(图1)。测序结果证实了PCR-RFLP分析结果的正确性。

2.2.2ATG4A基因多态性分析 对照组中突变等位基因A的频率高于病例组中的频率(37.7%vs.24.9%，P=0.006)，校正OR为1.989(95%CI：1.223～3.236)。与TT基因型相比，AA基因型携带者患肺癌的风险显著降低(校正OR=0.317，95%CI：0.174～0.575，P<0.001)，而在AT基因型的携带者中未发现显著关联。此外，SNP位点rs807185 多态性在隐性模型(校正OR=0.315，95%CI：0.178～0.556，P<0.001)和加性模型(校正OR=1.612，95%CI：1.228～2.115，P=0.001)中均显示与肺癌风险显著相关。非条件Logistic回归分析表明rs807185的等位基因与肺癌风险降低相关(校正OR=0.605，95%CI：0.456～0.803，P<0.001)。见表2。

注：A图为PCR-RFLP产物分析，泳道1、5、6、7、9、10、14和15显示TT基因型(222 bp)，泳道2、8、11、12和13显示AA基因型(134 bp和88 bp)，泳道3和4显示AT基因型(222、134、88 bp)。B图中不同基因型的部分序列显示在该色谱图和等位基因上，rs807185标有箭头，每个波代表色谱图中的一种核苷酸(A，T，G或C)，TT和AA具有一个波，然而，AT具有两个波，其中一个(较高波)代表T，另一个代表A。

图1采用PCR-RFLP和DNA测序对SNPrs807185进行基因分型

表2 病例组和对照组中ATG4A内含子SNP rs807185与肺癌风险的关联

注：a校正后的非条件Logistic回归模型，校正因素包括年龄、性别、吸烟史、饮酒状况、肿瘤家族史以及肺癌组织病理学分型和转移程度。

注：ATG4A SNP基因型与隐性模型不同亚组间肺癌风险的分层分析，不同亚组具有不同的校正后的年龄、性别、吸烟史、饮酒状况、肿瘤家族史，肺癌的组织病理学分型和转移程度。 *表示重要的OR。AC为腺癌；NSCLC为非鳞状细胞癌；SCC为鳞状细胞癌；SCLC为小细胞肺癌。

图2分层组中rs807185的校正优势比(OR)森林图

2.3分层分析 为了排除其他因素对结果的影响，本研究进一步进行了分层分析以评估rs807185的AA基因型对隐性模型中不同亚组肺癌风险的影响，结果如图2。在分别调整年龄、性别、吸烟史、饮酒状况、肿瘤家族史、肺癌组织病理学分类和转移程度后，rs807185位点的AA基因型与不同亚组肺癌发病风险的降低存在相关性，但在本研究的女性中没有观察到相关性。

3 讨 论

目前，自噬机制在癌症发生和发展中的作用尚未明确，部分研究者认为在不同的肿瘤类型和微环境中可能有着不同的作用。有报道认为在肺癌中自噬可能发挥抑制肿瘤的作用[6]。然而，一些研究仍支持自噬能够提高癌细胞存活率的观点[7]。自噬相关基因ATG4的表达增加与肿瘤发展和抑制以及癌症治疗抗性相关。因此，相关研究认为这些蛋白质可能在癌症治疗中发挥潜在或新靶点的作用[8]。至今，已经在哺乳动物中鉴定出4种自噬相关基因ATG4亚型(A～D)。ATG4B在结直肠癌细胞中的表达明显增加，ATG4B的抑制可降低自噬活性，从而使癌细胞对治疗剂敏感[9]。ATG4C与营养应激条件下自噬的减少相关，并最终导致对纤维肉瘤的易感性增加[10]。ATG4C过表达可阻止由共济失调-毛细血管扩张症突变基因(ATM)下调引起的乳腺癌干细胞微球体缺陷的发生[11]。ATG4D可作为结直肠癌发生中的癌抑制因子，有研究发现结直肠癌细胞中ATG4D的表达水平较癌旁组织明显下调[12]。WOLF等[3]曾报道过乳腺癌与自噬调节因子ATG4A之间的相关性。但ATG4A在自噬和致瘤性中的具体作用仍有待研究。以往研究报道ATG4A自噬基因突变(rs5973822)与克罗恩病中的肉芽肿有关(OR=4.13，95%CI：0.97～17.63，P=0.03)，但在比利时和以色列患者的病例对照研究中却未发现rs807185位点的差异[13]。ATG4A SNP的相互作用可能影响中国西南地区人群的HPV感染，由此ATG4A可能是宫颈癌的致病因子[14]。本研究结果表明，在AA基因型或A等位基因的携带者中，肺癌发展的风险显著降低。rs807185位点位于Xq22.1染色体ATG4A基因的内含子区上。有研究表明，内含子多态性处于连锁不平衡状态，具有一些功能多态性或一些与癌症或其他疾病风险相关的遗传转录[15]。因此，自噬相关基因ATG4A rs807185位点的突变，等位基因A或AA基因型可能对某些功能多态性或与肺癌患病风险相关的一些遗传转录产生影响。rs807185位点突变体可能调节ATG4A的表达水平，也可能影响其他一些蛋白质的表达与功能，并反过来影响自噬机制。究竟该位点如何发挥作用从而降低肺癌患病风险的具体机制尚不清楚，还需更多研究来阐明此现象。并且由于本研究是自噬相关基因ATG4A rs807185位点与肺癌易感性关联的初步研究，虽然发现了此现象，但样本量不够大，因此其结果仍需进一步扩大样本深入研究。

癌症与基因多态性的相关性研究日益受到重视，并且自噬也成为近年来癌症研究中的热点。但是目前，自噬通路中的自噬相关基因ATG4A rs807185位点与癌症易感性的相关研究仍较少。本文就自噬相关基因ATG4A rs807185位点SNP与重庆地区人群肺癌风险的相关性进行研究，结果显示，在重庆地区人群中，rs807185位点SNP与肺癌易感性降低存在相关性。因此笔者认为rs807185位点突变可能是肺癌的保护因子，其具体机制有待进一步研究。