基于RSM和GA-ANN优化超声-顶空气相色谱法测定植物油中六号溶剂残留量前处理条件

许均华,张红莉,贺 伟,邓湘波,李 勇,刘冠琼,徐文泱

(1.郴州市食品药品检验检测中心，湖南 郴州 423000； 2.湖南省食品质量监督检验研究院，长沙 410111)

随着我国人民物质生活水平的不断提高，人们对食用植物油的消费需求量增长强劲[1]。当前植物油的主要生产工艺有压榨法和浸出法。六号溶剂是食用植物油在浸出生产工艺中使用的主要萃取剂，它是一种低沸点的石油馏分，主要成分是C6～C8的烃类物质。若长期食用含该物质超标的食用植物油，消费者会受到呼吸中枢麻痹、周围神经和造血功能损害等威胁[2]。加强对浸出毛油、成品油生产工艺中溶剂残留量的监测，不仅可以提升油脂的品质，而且有利于创造更加安全的食品环境。

近年来，超声波技术由于操作简单、快速、成本低以及独特的物理和声化学效应等优点，在食品检测和食品工业中应用广泛[3]。目前利用超声波对植物油进行提取的研究较多[4-6]。然而，关于植物油溶剂残留量检测方法的研究主要集中在优化顶空条件上[7-8]。GB 5009.262—2016《食品安全国家标准 食品中溶剂残留量的测定》采用加热温度为60℃，平衡时间为30 min的顶空加热进样法(HGC)。虽然检测精度高，但是在实际检测过程中存在耗时长、检测效率低、加热温度较高等问题。因此，亟需建立一种快速、准确、实用的溶剂残留量检测方法。目前，鲜有利用超声波与顶空技术相结合进行植物油溶剂残留量快速检测方法构建的研究报道。

本研究拟利用超声波的生热、机械和空化等效应,采用超声波振荡平衡进行前处理[9]，通过构建响应面法(RSM)[10-11]模型和遗传算法-人工神经网络(GA-ANN)模型[12-13]对超声-顶空气相色谱法(UV-HGC)测定植物油中六号溶剂残留量的前处理条件进行优化，缩短顶空平衡时间，同时对实际检测效果进行了研究，以期为企业生产和基层实验室开展大规模检验提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

六号溶剂标准品(溶剂为N,N-二甲基乙酰胺，质量浓度10 mg/mL)，国家粮食局科学研究院；正庚烷(CAS:142-82-5)，HPLC级，上海安谱实验科技股份有限公司；N，N-二甲基乙酰胺(CAS:127-19-5，DMAC)，分析纯，上海金山经纬化工有限公司；大豆油、菜籽油、稻米油、芝麻油、花生油、玉米油、橄榄油、葵花籽油，购于郴州市本地市场(散装植物油共80个样品)和超市(品牌植物油共80个样品)。

ML204型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；5～100 μL移液器，Eppendorf AG；KQ-700GTDV型高频恒温数控超声波清洗器；DHG-9140B电热鼓风干燥箱；AOC-5000 SHIMADZU型恒温振荡器，日本岛津公司；GC-2010PLUS型气相色谱仪、FID检测器，日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的前处理

HGC：称量5.0 g(精确到0.01 g)基体植物油样品(六号溶剂残留量低于检出限)于20 mL顶空进样瓶中，然后迅速向顶空进样瓶中加入正庚烷标准工作液(68 mg/mL)5 μL作为内标，用手轻摇后再加入25 μL六号溶剂标准品，轻微摇匀后得到含有50 mg/kg六号溶剂和68 mg/kg正庚烷内标的基体植物油待测样，密封。保持顶空进样瓶直立，待分析。

UV-HGC：将1.2.1方法得到的基体植物油待测样,于超声波振荡器处理一段时间，待分析。

1.2.2 色谱条件

HGC：HP-5色谱柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；载气为氮气(纯度≥99.999%)，流速1 mL/min；色谱柱升温程序为初始温度50℃，保持3 min，然后以1℃/min的速率升温至55℃，保持3 min，再以30℃/min的速率升温至200℃，保持3 min；进样口温度250℃，FID检测器温度300℃；分流比100∶1；空气流速300 mL/min；氢气流速25 mL/min；进样量500 μL；顶空恒温60℃,保持30 min。

UV-HGC：将1.2.2 HGC条件修改为顶空恒温60℃,保持5 min，其余条件不变。

1.2.3 单因素实验

在UV-HGC方法中，固定条件为超声功率500 W、超声时间6 min、超声温度50℃、顶空平衡时间5 min，以色谱峰面积为指标，考察其中一个因素时，其他因素条件不变。

在HGC方法中,固定顶空平衡时间为11 min，以色谱峰面积为指标，对顶空温度进行考察。

1.2.4 数据处理

采用Origin2018进行单因素作图；采用Design-Expert8.0软件设计RSM，对每组实验数据进行方差分析(ANOVA)并进行结果的显著差异分析；采用MATLABR2016a构建ANN模型及GA寻优。

2 结果与分析

2.1 单因素实验(见图1)

图1 温度、超声功率、超声时间对峰面积的影响

从图1A可以看出，UV-HGC比HGC在相同温度时，峰面积更大。随着温度升高，峰面积都显著增大(P<0.05)，干扰峰逐渐增多，且到了70℃后峰面积上升趋势趋于平缓。原因是油脂中所残留的溶剂主要是C6～C8烷烃类的化合物，其沸点主要集中在60～90℃之间。另外各组分在顶空装置中的平衡温度与蒸汽压直接相关，温度、蒸汽压、顶空气体的浓度、分析灵敏度等因素成正相关关系。但是顶空进样时溶剂组分容易受过高的平衡温度导致其冷凝,降低了密封橡胶的气密性和进样精度。此外还会出现油脂基质分解、水蒸气产生、基线出现波动等现象，影响溶剂残留量测定。综合上述原因，考虑到超声与温度的耦合作用，超声温度选择40、50、60℃ 3个水平进行RSM实验。

由图1B可知，当超声功率增大，峰面积显著增大(P<0.05)，灵敏度提高，到了600 W后峰面积上升趋势趋于平缓，无显著性变化(P>0.05)。由于超声对油脂分子的搅拌及空穴作用增强，进而使其扩散层上的分子扩散急剧加快，有利于六号溶剂的逸出，加之在50℃超声温度的耦合作用下，越来越多的六号溶剂组分相继达到沸点，挥发到气相中，达到气相平衡。考虑成本和实用性，选择超声功率为400、500、600 W 3个水平进行RSM实验。

由图1C可知，峰面积随着超声时间的延长而增大(P<0.05)，超声时间达到12 min后，峰面积变化不显著(P>0.05)，表明气液两相之间基本达到平衡。由于平衡时间取决于被测组分分子从样品基质到气相的扩散速度，超声温度、超声功率不同，平衡所需的时间也不同，故选择超声时间为3、6、9 min 3个水平进行RSM实验。

2.2 RSM优化结果

2.2.1 模型建立与显著性检验

在单因素实验的基础上，以超声功率、超声时间、超声温度为自变量，以峰面积为响应值，根据Box-Behnken实验设计，优化超声前处理六号溶剂的条件。RSM因素与水平见表1。RSM设计和结果见表2，RSM方差分析见表3。

以A、B、C为自变量，峰面积(Y)为因变量，对实验所得的数据(3次重复实验的平均值)进行多元回归拟合分析，得到的回归方程为:Y=15.94+5.43A+1.67B+4.90C+0.63AB-0.74AC-0.53BC-2.61A2-1.00B2-1.72C2。模型P<0.01,决定系数(R2)为0.891 4。失拟项P为0.063 3(P>0.05)、变异系数(CV)为6.23%、均方根误差(RMSE)为0.785 6，失拟不显著，说明该模型拟合充分，效果较好。由表3可知，各因素对峰面积影响的主次顺序为超声时间>超声功率>超声温度。模型中一次项A、C为极显著因素，二次项C2为显著因素，A2为极显著因素，表明实验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。各因素与响应值之间的真实关系可以较好地被描述。但是各交互项AB、AC、BC均不显著(P>0.05)，说明该模型的因素交互作用对峰面积影响均不显著，不能很好地反映各因素之间的耦合作用。

表1 RSM因素与水平

表2 RSM设计和结果

表3 RSM方差分析

注：**差异极显著，P<0.01；*差异显著，P<0.05。

2.2.2 最佳条件的确定及验证

使用软件Design-Expert8.0分析回归方程得到最佳前处理条件为超声功率484.98 W、超声时间8.08 min、超声温度47.68℃，在此条件下峰面积的理论值为219 680 μV·s。考虑到实际可行性，将各实验条件修正为超声功率490 W、超声时间8 min、超声温度48℃，按照修正后的条件进行可靠性验证实验，并做3次重复实验，得到峰面积平均值为201 260 μV·s，理论值和实验值相差9.15%。由此可知，采用RSM优化超声前处理所得到的回归模型及最佳条件可靠。

2.3 ANN模型构建结果

2.3.1 ANN模型及分析

通过MATLABR2016a软件选取超声功率、超声时间、超声温度3个变量作为网络输入层节点，并归一化处理在0～1之间，峰面积作为输出层节点，运用反向传播方法建立三层神经网络模型。tansig函数和purelin函数分别作为隐含层传递函数和输出层传递函数，训练函数为trainlm函数，选用8个品种植物油共计160个实验样本所得的实验数据(每个样本重复3次实验)做ANN模型训练(如图2所示)，得到的输入与输出映射关系的网格，其初始种群为480。然后用测试样本测试ANN模型拟合的效果，最终确定ANN模型结构(如图3所示)。并对模型的拟合精度和预测精度进行评估。由图2可知，经过2次迭代后网络收敛精度达到10-4，样本训练能较快达到收敛。

图2 BP神经网络训练过程

图3 超声前处理六号溶剂的ANN模型

基于RSM实验条件(表2)所得数据(480组矩阵)作为样本，使用trainlm算法对神经网络进行训练。为防止过度拟合，在保证训练精度的情况下，尽量减少中间隐含层数量，训练后比较发现，当隐含层神经元为8时，能对实验数据准确拟合。所以本实验选择拓扑构为3-8-1的神经网络。通过设置BP网络训练参数(神经网络仿真次数为10 000，学习率为0.01，动量因子为0.1，目标误差为0.000 1)，分别比较训练集和测试集与其对应的预测值，可知其吻合度较好，均方误差符合预期设定(MSE=0.000 1)。

2.3.2 GA优化及结果验证

用实验数据对ANN模型进行模拟优化仿真，然后将训练完毕的较优模型作为GA的拟合函数，通过MATLABR2016a软件中GA遗传算法工具箱将ANN建模和遗传优化算法结合，寻找输入及输出变量的最优解。具体过程包括：采用二进制编码将各变量的参数集进行编码；将每代染色体种群设为20，最大进化代数为10 000，杂交概率为0.8，变异概率为0.02；适应度评价；判断是否满足终止条件，如不满足则进行循环，直到满足条件；输出遗传算法得到最优解。GA的迭代次数为100，采用浮点数编码，个体长度为1，优化过程中个体最优适应度变化曲线见图4。

图4 适应度曲线

由图4可知，在进化40代后达到最佳适应度。此时其峰面积已达到最大值，随后基本保持不变，经GA对超声前处理参数进行全局寻优，获得的峰面积预测最大值为223 410 μV·s，其对应的提取参数为超声功率494.12 W、超声时间7.12 min、超声温度49.34℃，考虑实际操作，将参数修正为超声功率500 W、超声时间7 min、超声温度50℃。用修正后的参数进行3次重复实验，得到峰面积平均值为210 870 μV·s。预测值与实验值相差5.95%，得到的峰面积高于RSM的。

2.3.3 RSM模型和GA-ANN模型的对比

按照RSM实验条件(表2)预测峰面积，对比峰面积的实验值和预测值，结果见图5。

由图5可知，RSM和GA-ANN两个模型的预测值和实验值在Y=X直线上分布情况。根据预测值进行计算，得出RSM和GA-ANN的均方根误差(RMSE)、预测标准误差(SEP)、R2分别为0.785 6、0.042 0、0.891 4和0.532 9、0.028 5、0.949 5。由此可知，GA-ANN模型拥有更大的R2和更小的RMSE、SEP，模型表现出较好的拟合能力以及预测能力。GA-ANN模型处理非线性问题的能力比RSM更强大，RSM的原理是通过建立二次多项式模型，而对非线性关系的数据拟合能力相对较弱；GA-ANN模型是根据现有的矩阵向量进行迭代计算，通过学习和存贮大量的输入-输出模式映射关系，建立预测模型，不像RSM模型预先需要给定函数。

图5 对比峰面积的实验值和预测值

2.4 经UV-HGC前处理后的气相色谱图(见图6)

注：1.2-甲基戊烷；2.3-甲基戊烷；3.正己烷；4.甲基环戊烷；5.环己烷；6.2，3-二甲基戊烷；7.正庚烷。

图6 经UV-HGC前处理后的气相色谱图

由图6可知，经过UV-HGC前处理后，植物油中的六号溶剂6个主峰与内标物(正庚烷)分离情况良好，且杂峰干扰少。

2.5 方法学验证

2.5.1 线性关系及检出限

以不同品种植物油为基体油，配制含内标的6种不同质量浓度的六号溶剂标准溶液，按照GA-ANN方法优化的UV-HGC参数条件进行测定。采用内标法定量，以六号溶剂中6个目标组分的总峰面积与内标峰面积比值(y)对六号溶剂的质量浓度与内标物正庚烷质量浓度比值(x)进行线性拟合，得到植物油的线性方程、线性范围、相关系数等。根据公式S/N≥3确定方法的检出限(LOD)，以S/N≥10确定方法的定量限(LOQ)，结果见表4。由表4可知，方法的灵敏度满足样品的定量分析及GB 5009.262—2016的限量要求。

表4 植物油中六号溶剂残留的线性方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限

2.5.2 结果准确度与仪器精密度

基体植物油经过超声波脱气，得到空白植物油待测样品，然后把植物油待测样品依次准确称量10份，分别添加高(200 mg/kg)、中(50 mg/kg)、低(10 mg/kg)3种不同加标量的六号溶剂标准品，每个加标量平行制备3份。其中留有1份不加标准品的植物油待测样品作为空白对照组，计算加标回收率及RSD。另外考察方法的精密度，植物油分别平行制备6份，添加中等加标量的六号溶剂标准品，按UV-HGC 方法进行测定，计算其精密度RSD，结果见表5。

表5 回收率实验和精密度实验结果

由表5可知，在低、中、高3个水平下，测定植物油中六号溶剂残留量的平均回收率分别为95.5%、98.6%、100.4%，RSD(n=9)不大于3.5%，准确度满足平均回收率在90%～110%范围内。植物油的精密度RSD(n=6)均不大于5%，与HGC(国标)法相比较，能达到国标方法要求，具有较理想的重复性和准确度。

3 结 论

本实验对显著因素进行筛选，并采用Box-Behnken实验设计，通过构建RSM模型和GA-ANN模型预测UV-HGC测定植物油中六号溶剂残留量的前处理条件。结果表明，在处理该非线性问题时，GA-ANN模型比RSM模型具有更好的拟合和预测能力。最终采用GA-ANN优化得到最佳超声前处理条件为超声功率500 W、超声时间7 min、超声温度50℃,在此条件下检测植物油中溶剂残留得到的峰面积为210 870 μV·s。UV-HGC法平衡时间为(超声前处理7 min，顶空平衡5 min)12 min。将该方法与国标方法关键步骤进行比较，结果表明，UV-HGC 法在达到国标检出限的基础上缩短了检测时间，提高了工作效率，达到了快速检测的目的，更适用于植物油中六号溶剂残留量的检测。