基于“味性化味一网络靶点一分子对接”的藏药五味麝香丸治疗“真布”病的作用机制研究

文成当智 张云森 仁真旺甲 才让南加 贡保东知 切尼项毛 才让吉 刚焕晨雷 张艺

中图分类号R29;R285

文献标志码A

文章编号1001-0408（2020）02-0164-09

DOI

10.603 9/j .issn.1001-0408.2020.02.08

摘要 目的：探讨藏药五味麝香丸治疗“真布”病（即类风湿性关节炎）的可能机制。方法：以《四部医典》《卫生部药品标准（藏药）》《晶珠本草》为依据，搜集五味麝香丸的组方、剂量及显味，构建矢量结构模型，从六味、三化味、十七效等层面分析该方的药性，并利用Gephi 0.9.2复杂网络软件构建其治疗“真布”病的“组方一药性一疾病”网络。利用中药系统药理学分析平台、有机小分子生物活性数据库检索五味麝香丸的有效成分，并利用BATMAN-TCM网络药理学研究平台预测有效成分对应的靶标蛋白，借助ETCM数据库检索“真布”病的相关靶标蛋白;在筛选两者共同靶标的基础上，利用DAVID 6.8生物信息学资源数据库进行基因本体（GO）分析和KEGG通路富集分析，使用Cytoscape 3.7.0软件构建五味麝香丸一“真布”病一靶标一通路网络并进行网络拓扑学分析，以筛选核心靶标。以Glide score为评价指标，利用Maestro Version 11.1.011软件将上述核心靶标与五味麝香丸有效成分进行分子对接。结果与结论：五味麝香丸含诃子、铁棒锤、木香、藏菖蒲和人工麝香，以诃子剂量最高。该方六味以苦、甘为主，三化味以苦化味为主，十七效以钝、凉、重等为主，主要对治锐、热、轻等二十种特性。“组方一药性一疾病”网络中，十七效与二十种特性之间边权重值较大的为凉效一热性、钝效一锐性、重效一轻性、稀效一臭性（边权重值≥430）等。共得到五味麝香丸有效成分潜在靶标2 306个，“真布”病相关靶标211个;两者共同靶标32个，其对应的有效成分共29种。GO分析共预测到52条相关结果，共同靶标主要位于胞外区、细胞核等部位，以免疫反应、炎症反应、细胞因子活性等生物学过程和分子功能为主。KEGG富集结果显著的有31条（P<0.05），涉及肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、癌症途径等信号通路。五味麝香丸一“真布”病一靶标一通路网络中，含有效成分、靶标、通路节点94个、边460条;TNF、自杀相关因子（FAS）、白细胞介素6（1L6）、IL10、自杀相关因子配体超家族成员6（FASLG）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、IL1B等是该网络中的核心靶标，分别与奎宁酸、百里酚、去氢表雄酮、诺卡酮等有效成分以范德华力、氢键、疏水作用力、Pi-cation键等连接，发挥治疗“真布”病的作用。

关键词 藏药;五味麝香丸;真布;类风湿性关节炎;味性化味;网络药理学;分子对接

类风湿性关节炎（RA）在藏医中称为“真布”（藏语： ）。藏医治疗“真布”病具有悠久的历史和显著的疗效[1]。藏医认为，“真布”是由黄水病变引起，其病理机制为三胃火失衡、糟粕入肝，进而影响变色赤巴功能，使未完全分离的血液进入胆囊，导致黄水遍于全身，并在关节淤积，诱发“真布”病（发病机制见图1）;此外，疫热、劳累、宁尼（意为白天嗜睡）等亦可引起赤巴热遍布全身，是“真布”病的另一诱因[2]。“真布”病在我国患病率很高，且持续处于较高的发病水平，具有致残率高和可引起多器官、多系统疾病等特点嘲。藏药五味麝香丸（藏语： ）始载于《四部医典》，现收载于2015年版《中国药典》（一部）[3]，由诃子（去核）、木香、人工麝香、铁棒锤（又名黑草乌）、藏菖蒲等5味藥材组合而成，主治“森”（意为微生物）引起的热症，如痤疮、疫热、疼痛、咽峡炎等，尤其对黄水所致疾病具有良好疗效，但目前关于该方治疗“真布”病的药性及作用机制尚缺乏深入研究。为此，本课题组构建了“味性化味一网络靶点一分子对接”三位一体的研究模式，拟从“方剂一药物一靶标一通路”等层面分析五味麝香丸治疗“真布”病的作用机制，以在传统藏药药性与现代网络靶点间建立联系，提高藏药方剂研究的系统性。

1 资料与方法

1.1 药性分析

1.1.1 数据来源以《四部医典》、《卫生部药品标准：藏药》[4]、《晶珠本草》为依据，搜集五味麝香丸的组方、剂量、显味（即药味）。

1.1.2 矢量结构模型构建 以组方矢量（B）、剂量矢量（T）、配伍矢量（D）等3种影响方剂药性的矢量为基础，应用前期研究中构建的藏药药性分析方法，即应用方剂组方六味比值公式[6]计算五味麝香丸中5种组方药材的六味比值（Y），Y=X/[n+（n-l）+（n-2）+（n-3）+（n-4）+（n-5）]，式中，“Y表示药味递减间隔，“X”表示显味比例（本研究设显味占0.9、隐味占0.1），“n”表示显味记载味数且1≤n≤6;应用“味性化味”矢量结构模型[5]计算方剂整体的六味比值（Rm），R=∑（B1TiD1+B2TD2+……

+BnTnDn），式中，“Rm”表示六味之某一味的比值总和，“n”表示方剂组方药物个数。根据六味与十七效的关系，计算十七效比值，并根据《四部医典》记载的六味、三化味、八性、二十种特性等的关系分析上述指标的相应比值。所得各比值越高，表明所对应的药性越强[嘲。

1.1.3 网络构建取“1.1.2”项下所得五味麝香丸的六味、三化味、八性、十七效等比值，根据十七效与二十种特性的关系，计算二十种特性与三因等数据，导入Ge-phi O.9.2复杂网络软件，采用“FaceAtlas 2”模块，并根据不同属性进行修正，构建五味麝香丸治疗“真布”病的“组方一药性一疾病”网络（网络中，节点代表方剂组方药材与疾病之间的潜在药性，边代表两者的内在关联）;在统计模块中分析边权重值，即节点之间的关联强度。

1.2 网络靶点分析

1.2.1 五味麝香丸有效成分及靶标筛选借助中药系统药理学分析平台数据库（TCMSP，http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）、有机小分子生物活性数据库（Pub-Chem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）等，检索五味麝香丸组方药材的有效成分及其结构信息，以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为筛选条件[6]，将筛选结果的“sdf格式文件导入BATMAN-TCM网络药理学研究平台（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），预测上述有效成分的对应靶标蛋白，并借助ETCM数据库（http：//www.nrc .ac.cn/9090/ETCM/index.php/Home/Index/index.html）检索“真布”病的相关靶标蛋白。

1.2.2 共同靶标筛选应用Excel 2016中的“SUMIF”“VLOOKUP”等函数，筛选五味麝香丸的有效成分和“真布”病的靶标蛋白，获取二者的共同靶标。

1.2.3 网络构建与机制分析将“1.2.2”项下所获共同靶标导入DAVID 6.8生物信息学资源数据库（https：//da—vid.ncifcrf.gov/）中进行“五味麝香丸一‘真布病一基因”的基因本体（GO）和KEGG通路富集分析;使用Cytoscape3.7.0软件构建“五味麝香丸一‘真布病一靶标一通路”网络，并进行可视化展示和网络拓扑学分析。网络中，节点代表化合物、靶蛋白、通路，边代表化合物一靶标一通路之间的相互关联。应用该软件中的“Network analyzer”功能，计算网络节点度值（该值反映了网络中与某节点相连边的数量），并选择网络中的核心靶标（节点度值≥11）进行分子对接[7]。

1.3 分子对接分析

1.3.1 数据来源将“1.2.3”项下所得核心靶标导人生物大分子空间结构（PDB）数据库（http：//www.rcsb.org），并下载其“pdb”格式文件;应用ChemBi0 3D UItra 14软件对与核心靶标相关的五味麝香丸有效成分结构进行优化。

1.3.2 分子对接应用Maestro Version 11.1.011软件的“Protein preparation wizard”插件对核心靶标进行对接预处理，通过“OPLS-2005力场”进行能量优化，在中性条件下加氢，优化氢键，优化均方根平均差（RMSD）至0.03 nm;以核心靶标活性空腔为对接中心，使用该软件的“Glide/receptor grid generation”模块生成格点文件;利用该软件的“LigPrep”模块建立小分子包裹，通过“OPLS-2005力场”进行能量优化，获得小分子配体;采用该软件的“Glide/ligand docking”插件将上述处理好的配体和靶标进行分子对接，为柔化配体非极性部分的电势，将比例因子设置为0.80，局部电荷阶段值设置为0.15，每个配体保留5 000个姿势，作为对接的初始阶段，选择“标准精度（SP）柔性对接”，进行对接后将能量最小化，设“拒绝最小姿势”的能量阈值为0.50 kcal/mol（1 cal=4.19 J），对接效果评价采用“Glide score”评分功能。该评分以“Chem score”为基础，且包含了一个空间冲突项，并添加了其他奖罚项[如隐极性项（根据薛定谔设计来惩罚静电失配）、酰胺扭转项、疏水封闭项和排除体积项]，可作为评价化合物与蛋白结合能力的综合性指标。将对接分子的Glide score绝对值由高到低进行排序，以阳性对照药和自身配体作为参考;若无，则参考Glide score绝对值>5[5-9]。

2 结果

2.1 药性分析结果

2.1.1 组方和剂量五味麝香丸中，诃子的组方剂量最高，其次为铁棒锤;药味以苦味为主，详见表1。

2.1.2 药性分析根据“味性化味”矢量结构方程，推算五味麝香丸的六味药性和三化味药性，发现该方六味以苦、甘为主，三化味以苦化味为主，十七效以钝、凉、重等为主，八性以凉为主，主要对治锐、热、轻等二十种特性，详见表2、表3、图2（表3、图2中，“*”表示赤巴之轻）。

2.1.3 构建“组方一藥性一疾病”网络根据六味、十七效、二十种特性、三因等的关系，构建五味麝香丸治疗“真布”病的“组方一药性一疾病”网络，发现十七效与二十种特性之间边权重值较大的为凉效一热性、钝效一锐性、重效一轻性、稀效一臭性（边权重值≥430）等。其中，凉效和钝效、稀效等主要来自诃子的涩味、木香的苦味等，重效主要来自铁棒锤的甘味等;主要通过钝效、凉效、稀效对治锐、热、臭等赤巴的特性来调整病症，详见图3（图中，“&”为八性，“*”为十七效，“#”为二十种特性;“sx”为麝香，“hz”为诃子，“mx”为木香，“tbg”为铁棒锤，“zcp”为藏菖蒲）。

2.2 网络药理学分析结果

2.2.1 五味麝香丸一“真布”病一基因的GO分析结果共得到有效成分潜在靶标2 306个，“真布”病相关靶标211个;二者共同靶标32个，其对应的有效成分共29种。经GO分析，共预测到两者共同靶标的52条生物学功能相关结果。其中，生物学过程以免疫反应、炎症反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的阳性调控、参与凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性的激活等为主;分子功能以细胞因子活性、花生四烯酸结合等为主;细胞部位以胞外区、细胞核、细胞外间隙等为主，其中富集基因数较多的15条生物学功能见表4。

2.2.2 五味麝香丸一“真布”病一基因的KEGG通路富集分析结果两者共同靶标共筛选出KEGG富集通路33条，其中P<0.05的有31条。肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、癌症通路、细胞因子一细胞因子一受体相互作用等15条通路富集的基因数≥3，详见表5（按富集基因数量由多到少排列）。

2.2.3 五味麝香丸一“真布”病一靶标一通路网络构建的五味麝香丸一“真布”病一靶标一通路网络详见图4（图中，“▲”表示有效成分，“◆”表示靶标蛋白，“●”表示通路;MIF为巨噬细胞移动抑制因子，FAS、FASLG为自杀相关因子及其配体超家族成员6，IL1B、IL1O、IL6为白细胞介素亚型，BDKRB2为缓激肽B2受体，NOD2为核苷酸结合寡聚域样受体2，SLC22A6为人类有机阴离子转运蛋白1，PTGS2为前列腺素内过氧化物合酶2，GNAS为鸟苷酸结合蛋白活性刺激肽，PIK3RI为磷脂酰肌醇3激酶调节亚基1，TNFSF11为肿瘤坏死因子配体成员11，COMT为咖啡酸-O-甲基转移酶，LRRC8A为富含亮氨酸重复蛋白8A，TCF3为T细胞因子3，RAGI、RAG2为重组激活基因蛋白亚型，TNFAIP3为肿瘤坏死因子cc诱导蛋白3，HPRTI为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1，APOE为载脂蛋白E，GDF5为生长分化因子5，TRPV1为瞬时受体电位香草酸受体1，PTPN2为非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶2，S1OOA8、S1OOA9为血清S1OO钙结合蛋白A8、A9，ALOX5AP为5一脂氧合酶激活蛋白，COLIA1为胶原蛋白I，PLA2G1B为磷脂酶A2 IB，COL5A1为人V型胶原al链，ALOX5为人花生四烯酸5一脂加氧酶）。由图4可见，该网络共含共同靶标相应有效成分、靶标、通路等节点94个、边460条。

“五味麝香丸一真布病一靶标一通路网络”靶标的节点度值详见表6。由表6可见，TNF、FAS、IL6、IL1O的节点度值较高，可能是五味麝香丸治疗“真布”病的核心靶标。

2.3 分子对接结果

选择网络节点度值≥11的7个核心靶标（TNF、FAS、IL6、IL1O、FASLG、PTGS2、IL1B）与五味麝香丸的29种有效成分进行分子对接，结果见表7（表中，“一”表示无对应Glide score;有3种成分Glide score的绝对值小于自身配体或小于5，故未列出）、图5（对接结果以Glide score绝对值最高的为例）。

奎宁酸可与FASLG、IL6很好地结合，Glide score分别为- 5.932、- 6.703，且该化合物与IL6结合的Glidescore绝对值大于IL6阳性对照药穿心莲内酯的Glidescore（-4.283）绝对值。从2D和3D构象可见，奎宁酸可分别与FASLG、IL6的Loop区中的氨基酸残基形成6个氢键，并完全处于两个靶标的疏水Loop区内，表明该化合物主要通过范德华力和氢键的方式与这两个靶标结合。

百里酚与FAS、IL1B的结合亲和力较强，Glide score分别为-4.231、-6.383，其绝对值分别大于FAS自身配體和IL1B阳性对照药米诺环素的Glide score（-4.012、- 4.954）绝对值。从2D和3D构象可见，百里酚可与FAS中的氨基酸残基Arg55形成Pi-cation键、与Gly66形成氢键;与IL1B中的Lys65形成氢键;此外，由于各键定向力（如结构中羟基、氨基等强吸电子基或苯环等供电子基）的差异，导致化合物在结合区域中的位置构型发生了一定的变化，从而影响整个蛋白的构型。

去氢表雄酮与PTGS2、TNF的亲和力尚可，Glidescore分别为-7.313、-6.821，但其绝对值均略小于靶标的自身配体的Glide score（- 10.182、- 6.954）绝对值。从2D和3D构象可见，去氢表雄酮仅与TNF中的TyrB151形成1个氢键;此外，去氢表雄酮虽未与TNF、PTGS2形成大量氢键，但化合物整体处于两个靶标的疏水Loop区内，提示氨基酸和化合物自身的疏水作用力同样可使配体与靶标稳定结合。

诺卡酮与IL10结合的Glide score为-6.428。两者的结合较为特殊，其既未生成氢键，也无共轭等相互作用力，原因可能与IL10蛋白结构较为简单有关。但从两者结合的3D构象可见，诺卡酮位于IL10的3个cc螺旋链中，处于氨基酸最为丰富的位置，且位于适于结合的疏水空腔内，故两者的结合较为稳定。

3 讨论

藏医认为“真布”病是由于久居湿地、食用凉黏腻性食物等外因引起三胃火失衡，逐渐导致关节部位“三火”功能紊乱而引发，其病机由培根偏盛逐渐转化成赤巴偏盛[10]。本研究以“味性化味”理论分析五味麝香丸的药性，发现该方在六味中苦、甘、涩味偏盛，累计占比超过70%;这三味均属凉性，皆具有对治赤巴的作用，且甘味也有克制隆的作用。三化味中苦化味占62.0%，根据三化味与三因的关系，提示该方经三胃火消化后凉性增强，药性峻烈，可对治极度偏盛性赤巴。十七效以钝、凉、重、稀、糙等为主，其中钝、凉、稀等可对治锐、热、臭（有“稠”之寓意）等赤巴特性引起的生疮糜烂、热性病症、津血黏稠等病机，重可对治轻等隆特性引起的触觉敏感、游走性疼痛等，而糙可对治粘柔等培根特性引起的微管污垢增多、脉络堵塞等病机。因此，五味麝香丸的药性有效对治“真布”病的局部热症、黄水沉积、微管堵塞等赤巴性病机，可见藏医治疗“真布”病不仅考虑了病机的发源，还注重三因的盛衰和热寒的平衡。从“味一化味一性一效”的“味性化味”组合视角来看，该方具有“苦甘涩味一苦化味一重凉性一凉钝稀重效”药性组合，对治“热锐臭一赤巴一热”的疾病特性组合，形成药性组合与特性组合的轴承关系，从“真布”病的热寒、三因、二十种特性等层面进行多层次、多维度治疗，有效揭示了五味麝香丸治疗“真布”病的药性途径，也初步揭示了藏医治疗慢性热性疾病的隐形规律。

本研究以维持机体平衡的基因网络作为整体、以五味麝香丸有效成分与“真布”病的共同靶标为切入点，利用网络药理学方法分析发现，五味麝香丸的有效成分主要集中在胞外区、细胞核、细胞外间隙等部位，主要通过TNF信号通路、细胞因子一细胞因子一受体相互作用等信号通路，细胞因子活性、花生四烯酸结合等分子功能以及免疫反应、炎症反应等生物学过程来发挥治疗“真布”病的作用。网络拓扑学分析共筛选出TNF、FAS、IL6、IL10、FASLG、PTGS2、ILIB等7个核心靶标。

本研究进一步将上述7个核心靶标与五味麝香丸的29个有效成分进行分子对接，有26个成分可与靶标实现对接;奎宁酸、百里酚、去表雄酮、诺卡酮可与FASLG、IL6、ILIB等核心靶标较好地连接。其中，TNF信号通路可促使促炎症细胞因子（IL1B）、趋化因子、生长因子和TNF-a本身等编码基因的表达，从而放大机体炎症反应和免疫效应[11-12]。TNF在炎症发生过程中具有核心作用，其主要由巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌，是“真布”病治疗的靶标之一。过度分泌的TNF-a可刺激白细胞浸润，活化内皮细胞生成血管，并诱导细胞因子、趋化因子、黏附分子以及基质酶的生成，从而导致滑膜炎症反应和关节破坏[13-14]。此外有研究发现，TNF-α能激活NF-KB，后者活化后不仅可增强TNF-a、IL6、黏附分子等编码基因的转录水平，还可借助其与炎症因子间的正反馈效应使炎症反应和机体损伤持续恶化;同时，NF-KB还与血管翳形成和软骨侵蚀密切相关[15-16]。本研究分子对接结果显示，麝香的有效成分去氢表雄酮和百里酚分别可通过范德华力和疏水作用力与TNF、IL1B结合，从而影响靶标的活性。FAS是一种存在于多种细胞系中的细胞表面受体分子，FASLG为其配体。FAS/FASLG系统凋亡障碍可产生大量的自身抗体，使关节组织细胞异常增殖，从而引发炎症反应，最终诱发“真布”病[17-18]。本研究分子对接结果显示，诃子的有效成分奎宁酸可与FASLG Loop区中的氨基酸残基形成6个氢键，麝香的有效成分百里酚可与FAS的氨基酸残基形成Pi-cation键、氢键，可能是该配体活性下调的主要原因。IL6水平变化与“真布”病免疫炎症和骨质破坏密切相关，且在造血过程中也具有重要作用[19-20]。IL6可诱导上皮细胞增殖形成血管翳;同时可作用于内皮细胞表面以激活黏附分子，从而诱导肝细胞合成多种急性时相蛋白，驱动B细胞分化并产生免疫球蛋白、类风湿因子，激活效应T细胞以及抑制调节性T细胞的反应[2l]。当生长因子和IL6等分泌异常时，破骨细胞和成骨细胞间的平衡被打破，从而造成骨破坏，其水平高低可间接反映“真布”病患者的病情严重程度[22]。本研究分子对接结果显示，诃子的有效成分奎宁酸可与该靶标Loop区中的氨基酸残基形成6个氢键，这可能是IL6水平变化的原因之一。PTGS2是一种诱导因子，在炎症介质、细胞因子、促癌剂、激素等因素诱导下表达，可催化产生前列腺素等具肝毒性的炎症介质，是炎症发生的重要环节，在免疫调节、炎症反应、脂质代谢、细胞凋亡等生物过程中具有至关重要的作用[23-24];同时，PTGS2也是自发性关节炎的主要相关因子，与“真布”病的发生相关[26]。本研究分子对接结果显示，麝香的有效成分去氢表雄酮与PTGS2的Glide score为-7.313，亲和力强，且结合位点位于Loop区，可通过疏水作用调节靶标的活性。ILIO为抗炎细胞因子，可拮抗NF-KB信号通路的活性进而发挥抑制炎症反应的作用，同时还可对部分炎症反应起到负调控作用[26]。本研究分子对接结果显示，木香的有效成分诺卡酮可与IL10较好地结合，虽未见氢键、共轭等相互作用力，但该化合物可通过靶标cc螺旋链中的疏水空腔与IL10稳定结合，从而达到增加IL10分泌、抑制炎症反应的目的。

综上所述，TNF、FAS、IL6、IL10、FASLG、PTGS2、IL1B等可能为五味麝香丸治疗“真布”病的核心靶标，分别与奎宁酸、百里酚、去氢表雄酮、诺卡酮等有效成分以范德华力、氢键、疏水作用力、Pi-cation键等连接，发挥治疗作用。本研究基于藏药药性理论，结合前期研究构建的“味性化味”矢量结构模型，并应用网络靶点和分子对接等分析方法，对藏医常用方剂五味麝香丸治疗“真布”病的作用机制进行了多维度、多层次分析，对藏药方剂的药性分析和临床应用具有积极意义，可为揭示藏医思维的科学价值和传承临床用药的内在规律提供理论支撑。但本研究仅借助网络药理学和分子对接等生物信息学方法对五味麝香丸治疗“真布”病的作用机制进行预测，暂未能进行细胞、动物等生物学验证，因此本课题组将继续汇总并研究藏医古籍记载的五味麝香丸不同配伍剂量的药性并进行多成分一多靶点一多通路的生物学验证，从而实现五味麝香丸的“剂量定位一临床定位”。

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（收稿日期：2019-06-20修回日期：2019-11-25）

（編辑：张元媛）

△基金项目：国家重点研发计划中医药现代化研究重点专项（No.2017YFC1703904）;国家教育部“藏羌彝走廊民族医药传承与创新的大数据共享模式研究”（No.16XJC850001）

* 博士研究生。研究方向：藏医药基础与信息化。E-mail：wenchengdangzhi@aliyun.com

#通信作者：讲师。研究方向：藏医药教学及现代化。E-mail：417568314@qq.com