肝纤维化分子机制及治疗靶点研究进展

(中国药科大学基础医学与临床药学学院，江苏 南京 211198)

肝脏是体内主要的代谢器官，具有强大的再生能力。肝损伤发生后肝脏通常可以再生，但若存在长期损伤与慢性炎症刺激，肝脏的再生能力将极大地被削弱，并引起纤维化发生。肝纤维化(liver fibrosis，LF)是慢性肝病进展至肝硬化(liver cirrhosis，LC)的关键步骤，它是一种机体代偿修复反应。多种病因如酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、病毒性肝炎、慢性胆汁淤积及自身免疫性肝炎都可发展为纤维化而进展至肝硬化和肝癌，给患者生命健康带来严重威胁。探究肝纤维化发病的相关机制、寻找有效的预防及治疗靶点，抑制疾病的进一步进展，对于维护肝纤维化患者的生命健康有极大的临床意义。综述肝纤维化发生过程中的相关分子机制及现阶段研究的可能靶点，旨在为肝纤维化的治疗提供研究依据。

1 肝纤维化发生的分子机制

1.1 转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)水平上调

大量的研究表明，TGF-β在多种纤维化疾病的发生及进展过程中起重要作用[1]。在肝脏中，库普弗细胞与肝星形细胞(hepatic stellate cell，HSC)是产生TGF-β的主要细胞。TGF-β在正常状态下以非生物学活性形式存在，只有被加工后才能发挥作用，TGF-β可被αv整合素激活，促进肝脏纤维化[2]。在HSC中，TGF-β介导Smad2/3激活可促进I型和III型胶原的转录，从而使肝纤维化进一步发展。Smad信号传导通路还促使Smad7转录，Smad7对TGF-β信号通路有负调节作用[1]。Ding等[3]研究证明，维生素D核受体(vitamin D receptor，VDR)在调节TGF-β/Smad信号传导通路中也有重要的作用。VDR激活后可以拮抗Smad与HSC中纤维化相关基因启动子区域的结合。因此，VDR缺乏促进了维生素D的治疗作用，减轻了小鼠的肝纤维化。且有研究[4]表明，在脂质生成过度的肝细胞中，TGF-β信号通路可通过调节肝细胞的凋亡，继而激活HSC以促进肝纤维化。此外，TGF-β还可诱导肝细胞中的结缔组织生长因子，从而使得肝纤维化进展[5]。

1.2 炎症因子浸润

肝纤维化进展过程中，多种炎性细胞因子如IL-17、IL-22、IL-33及IL-13等发挥重要作用。IL-17是一种促炎及促纤维化的细胞因子，由Th17细胞产生，在酒精性肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎及自身免疫性肝炎中均有上调。IL-17产生后可激活库普弗细胞与HSC中的NF-κB与STAT3信号通路。同时，HSC被激活后，胞内胶原蛋白α1、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)及TGF-β水平均被上调，这些因子都是纤维化发生过程中的标志物[6]。除IL-17外，Th17细胞也可产生IL-22。IL-22可通过STAT3通路调节细胞增殖、组织修复及代偿反应等多种细胞内生物学活动的发生[7]。在肝硬化患者中，IL-22表达被显著上调，且IL-22水平与肝硬化进展程度、并发症的发生率及肝硬化病死率等呈正相关[8]。除此之外，IL-33也是参与纤维化进展过程中重要的炎性因子[9]。在肝硬化患者中，IL-33及其受体水平升高；在CCl4诱导、TAA诱导及曼氏血吸虫感染所引起的肝纤维化中，IL-33的表达均有所升高[9]。且IL-33被释放出肝细胞后，可诱导Ⅱ型肝固有先天性淋巴样细胞产生IL-13，进一步增强HSC中的TGF-β信号通路，促进纤维化发生及进展[9]。

1.3 Toll样受体4(toll-like receptor 4, TLR4)及肠道菌群

肝纤维化及肝硬化患者血浆与门静脉内毒素如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)增加，且有肠道渗漏及细菌过度生长与营养不良的状况。因此，迁徙的肠道微生物及LPS的内源性传感器TLR4可能是促进肝纤维化进展的影响因素[10]。在Seki等[11]的研究中，与野生型小鼠相比，TLR4突变型小鼠及经肠道灭菌小鼠均不会发展成肝纤维化，但纤维化过程中，TLR4突变型小鼠血液LPS水平与野生型小鼠水平一致，这表明TLR4主要发挥作用的地点是肝脏。活化的HSC表达TLR4，其配体可通过两个不同的靶标HSC和库普弗细胞调节肝纤维化。TLR4和肠道菌群对于肝纤维化是必不可少的，并且TLR4下调静态HSC上的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)和激活素膜结合抑制剂(一种TGF-β受体的诱饵受体)来增强HSC中的TGF-β信号，从而促进纤维化反应[12]。TLR4信号传导通路还通过抑制miRNA-29表达来调节HSC活化和肝纤维化[13]。

不同病因的肝脏疾病对于肠道微生物环境的影响各不相同，在由胆管结扎术引起的肝纤维化改变中，前期病变时肠道内即存在细菌的过度生长，但肠道菌群的组成并未受到影响。而由慢性CCl4诱导的肝纤维化仅在纤维化进展后期才影响肠细菌的组成[14]。单纯的胆管结扎术不会引起营养不良，但是同时给予高脂饮食则会显着改变胆管结扎术后肠道细菌的组成(革兰氏阳性菌比例增加以及拟杆菌和硬生菌比例降低)。与基础饲料喂养的对照组小鼠相比，高脂饮食喂养的小鼠诱导的肝纤维化增加[15]。Dapito等[16]进一步从高脂饮食联合胆管结扎术小鼠中纯化了“纤维化”革兰氏阴性细菌，并证实这些“纤维化”细菌显着增强了肝纤维化，在由肝纤维化进展至肝癌的动物模型(DEN + CCl4)中，TLR4突变小鼠与野生型的肠道微生物组组成相似，这表明TLR4并不参与慢性肝损伤期间在肠道营养不良的发生。然而，一项关于使用无菌动物进行肝纤维化的研究[17]表明，无菌小鼠更易受到肝毒素诱导的肝纤维化的影响，这表明，在肝纤维化进展过程中，肠道内除了有害细菌的增加外，还存在有益于防止肝纤维化的细菌。

1.4 HSC衰老

发生肝纤维化及肝硬化的肝脏中常存在衰老的HSC。与具有增殖能力的HSC相比，衰老的HSC丧失了增殖能力及产生胶原蛋白的能力，细胞内炎症反应的发生增多，产生较多的炎症因子[18]。p53是衰老相关基因，缺乏p53基因的小鼠体内分离出的HSC较野生型小鼠的HSC有更强的增殖能力，且比野生型小鼠表现出更严重纤维化作用，表明由p53介导的衰老的发生抑制了体内纤维化的发展[19]。Lujambio等[20]研究则表明，在衰老的HSC中，p53的表达与肝巨噬细胞的M1态相关。M1态是一种肝巨噬细胞衰老相关分泌表型的极化态，该状态下，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的发展被抑制。该研究还证实了p53-/-的HSC能够诱导巨噬细胞分化为M2型，可通过干扰肿瘤微环境促进癌细胞增殖。但Dapito等[16]的研究中，肝巨噬细胞衰老相关分泌表型可以促进由肥胖导致的HCC，且由肥胖介导的HSC衰老与肝纤维化无关。因此，HSC的衰老在肝纤维化发生发展过程中的作用仍有争议，需要在今后研究中进一步探究。

1.5 自噬

在活化的HSC中可观察到自噬的发生，抑制自噬作用可抑制HSC的活化及增殖[21]。若小鼠体内的HSC的自噬作用被抑制，HSC的活化及纤维化均减少。且由于自噬与脂质降解相关，HSC自噬减少会导致细胞难以降解脂滴且处于静止状态，这表明自噬是HSC活化的必要条件[21]。α1型抗胰蛋白酶(alpha-1 antitrypsin，α1-AT)缺乏症是一种常见的遗传性疾病，该病的发生主要由于肝细胞内质网中累积了大量突变的Z蛋白。α1-AT Z蛋白突变的小鼠可表现出人类α1-AT缺乏症的许多典型特征，如肝纤维化[22]。在α1-AT缺乏症的患者体内及Z蛋白突变的小鼠体内，普遍可以观察到肝细胞的自噬作用，自噬囊泡中包含有α1-AT突变的Z蛋白。且给予卡马西平或雷帕霉素可抑制α1-AT突变的Z蛋白在肝脏中积累和肝纤维化的发生[22-23]。因此，自噬是HSC激活所必需的，肝细胞中的自噬作用与许多肝脏疾病(例如α1-AT缺乏症、ALD和NASH)的发生具有相关性。

2 肝纤维化治疗

2.1 肝纤维化的可逆转性

在啮齿动物及人肝脏晚期肝纤维化的早期阶段，若消除了慢性炎症或慢性损伤的主要诱因，肝脏可逆转至正常功能，这一结论已经在多个研究中证实[24-25]。这些改变包括以降低体质量为目的调整NASH患者的生活方式，长期干扰及抑制或杀死慢性丙型肝炎及慢性乙型肝炎患者体内的病毒等。晚期肝纤维化及肝硬化的可逆转性这一结论最重要的临床价值在于其可以防止肝脏失代偿的发生，但这种可逆转性并不能消除肝癌进展的风险[26]。一旦消除了肝脏疾病和纤维化刺激的主要诱因，疾病的进展不仅会停滞，而且伴随着纤维溶解的发生，代偿性的肝硬化可逆转至正常功能的肝脏。但是在接受抗病毒治疗的患者中，有15%～25%并未显示出肝纤维化的逆转，甚至会继续进展，这表明依靠改变或控制诱因促使自发逆转的过程是缓慢的，且无法预防危及生命的并发症[27]。

2.2 肝纤维化治疗靶标

2.2.1 胶原蛋白合成

许多细胞外基质(extracellular matrix，ECM)分子既可以作为治疗纤维化的指标又可以作为治疗靶点[28]。胶原蛋白是纤维化发生时最丰富的ECM蛋白，占肝硬化肝干重的50%[29]。其中，I、III和V型胶原蛋白的复合原纤维来自中央结构，其他胶原蛋白、非胶原糖蛋白和蛋白聚糖直接或间接附着于中央结构，从而为细胞提供锚固作用并维持器官结构和体内平衡[29]。所有ECM分子不仅可以作为细胞或组织的结构框架，而且还可以作为完整的超分子结构发挥作用。慢性疾病和炎症中，纤维形成和纤维分解过程的平衡紊乱最终导致肝脏单向性和持续性修复，即用功能失调的组织填充功能缺损的瘢痕组织，该过程由与纤维化发生相关的“不良胶原蛋白”主导发生[29]。但最近的研究还未探究清楚仅抑制I型胶原(最丰富的瘢痕胶原)的合成是有益还是有害的，因为这种抑制可能导致器官功能障碍并可能促进肿瘤的生长。通过在脂质复合物中使用优化的前胶原α1-Col1a1 siRNA，可以实现特异性的抑制体内I型胶原蛋白的合成。这些脂质复合物的应用可使胆汁淤积性肝纤维化的小鼠模型中90%的Col1a1合成抑制，晚期肝纤维化开始治疗时，肝脏中总胶原积累减少50%。研究结果[30]表明，此过程没有肝脏炎症增加，且肝脏中促炎细胞数量减少。在敲除Col1a1基因的小鼠中，证实Col1a1是肝纤维化的有效靶标，其抗纤维化作用与脂质复合物诱导的治疗相似，抑制的I型胶原合成具有良好的抗炎作用[31]。最近的一项针对10例纤维化NASH患者的1期临床试验结果表明，应用胶原蛋白特异性抗纤维化治疗具有一定的效果，且短期内的安全性可以保证[32]。以纤维化形成中起关键作用的其他胶原蛋白和ECM分子做为靶标的研究才处于起步状态。

2.2.2 纤维化发生相关分子

IL-30可通过诱导活化的HSC及NK细胞的胞膜活化性受体NKG2D来减缓肝脏纤维化，IL-30可促进肝NKT细胞表面NKG2D表达，从而增强其对活化的HSC的细胞毒活性作用，从而抑制肝纤维化[33]。因此，这可以作为一种治疗肝纤维化的理想疗法。而Kim-Kaneyama等[34]研究中，过氧化氢诱导的Clone 5(hydrogen peroxide-inducible clone-5，Hic-5)是一种TGF-β1诱导的黏着斑蛋白，Hic-5可促进细胞在各种器官中的增殖和ECM的扩增，且有助于血管的恢复和重构。然而，最近的一项研究表明，在人和小鼠活化的HSC中，Hic-5可通过下调Smad7来增强TGF-β诱导的Smad2磷酸化，从而在减轻纤维化中起关键作用[35]。这些数据表明Hic-5是一种新型治疗靶标，也是活化HSC的潜在标志物。此外，酰基辅酶A-胆固醇酰基转移酶(acetyl-coenzyme A acetyltransferase，ACAT)由两种同工酶ACAT1和ACAT2组成，在游离胆固醇转化为胆固醇酯过程中起催化作用。游离胆固醇积累可通过促进TLR4信号转导，从而调节HSC活化和肝纤维化的发展。由于ACAT1在调节HSC中的游离胆固醇积累中起着至关重要的作用[36]，因此现阶段研究集中在开发针对肝纤维化的ACAT1参与的治疗性干预措施。

2.2.3 肝纤维化发生相关细胞

调节性T细胞通过调节NK细胞与活化的HSC之间的相互作用来调节丙型肝炎病毒依赖性肝纤维化[37]。Treg细胞以细胞接触依赖性的方式通过分泌可溶性IL-8和/或TGF-β1来降低NK细胞对HSC的生物学作用，并下调HSC内重要的NKT活化配体[38]。由其他病因引起的纤维化中可能也存在这种机制，但需要进一步的研究来证实。

巨噬细胞可分为M1型巨噬细胞(属于经典活化型)和M2型巨噬细胞(属于另类活化型)，它们在肝纤维化的进展和消退中起着双重作用[39]。通常，M1型巨噬细胞产生炎性细胞因子，而M2型巨噬细胞调节炎性反应和组织修复。M1和M2型巨噬细胞的失衡介导了肝纤维化的进展和消退[40]。在肝损伤的早期阶段，骨髓来源的单核细胞被广泛募集到肝脏，然后分化为炎性巨噬细胞(主要是M1型巨噬细胞)以产生促炎细胞因子和促纤维化细胞因子，从而促进炎症反应和HSC活化。之后，募集的巨噬细胞(主要是M2型巨噬细胞)转换为分泌MMPs(降解ECM的主要酶)的表型，以修复纤维化[39,41-42]。

在先天免疫细胞中，肝巨噬细胞在纤维化的形成和纤维溶解中均起关键作用[43]。而再次受到损伤后，肝库普弗细胞通过募集其他先天免疫细胞来启动纤维化反应，这些浸润细胞可产生多种细胞因子和趋化因子，许多因子可直接有效地促进HSC的炎症及纤维化发生[44]。巨噬细胞因其纤溶特性，可以作为原发性损伤被抑制的逆转过程中的治疗方向，即以巨噬细胞为目标，以趋化因子受体抗体或巨噬细胞活化受体为治疗靶标来预防纤维化相关因子的流入及活化可能是一种有效的肝纤维化治疗策略。但这些疗法尽在进展过程中有效，而无法解决纤维化的逆转过程，有可能的原因是需要寻找到有纤溶作用的纤溶巨噬细胞。因此，若以肝纤维化的可逆转性为治疗方向，需要寻找在纤维化进展及消退期间均诱导或促进从促纤维化巨噬细胞向纤溶巨噬细胞转变的靶标和疗法。

3 问题与展望

在过去的十年内，人们对肝纤维化的认知取得了极大的进步。作为一种动态的过程，肝纤维化主要发生在各种慢性肝损伤导致的ECM及瘢痕组织的积累过程中，可由多种慢性肝损伤相关的病因引起，其发生不仅影响患者生活质量，也给患者及其家庭带来较大的经济负担，因此肝纤维化的预防及治疗有重要的临床意义。本综述概括了肝纤维化发生过程中所涉及的主要分子机制及相关治疗靶点，但尽管研究人员对于纤维化发病机理的认识取得巨大进步，很多基本问题包括肝脏为何再生、纤维化与再生功能受损有何联系、纤维化是如何进展至肝癌等问题尚待解决，现阶段研究还主要集中在临床前阶段，很难发现针对各种病因引起的肝脏纤维化的通用疗法。将肝纤维化细胞及分子基础研究的发现转化为临床的治疗方案，获得更多的临床数据，是未来研究人员继续努力的方向。