不同贮存温度、培养基及四环素对培菲康胶囊活菌数的影响

徐爱国

摘 要 本研究探讨了影响培菲康胶囊活菌数的因素：贮存温度、培养基和四环素。结果表明：在25、30和37 ℃放置7 d，每粒胶囊所含长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌及粪肠球菌活菌数均大于1×107 CFU/g，其中，在25 ℃条件下，活菌数最多，表明菌株存活率最高；血平板中长双歧杆菌活菌数明显高于GAM 日本日水和GAM青岛日水培养基中的活菌数，说明血平板更适宜长双歧杆菌的生长。

关键词 培菲康胶囊 贮存温度 培养基

中图分类号：R944.5 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2020）17-0071-04

Effects of different storage temperatures， media and tetracycline on the number of living bacteria in Bifico capsules

XU Aiguo*

（SPH Sine Pharmaceutical Laboratories Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China）

ABSTRACT The factors affecting the number of viable bacteria in Bifico capsules were studied， including storage temperatures， media and tetracycline. The results showed that the number of live bacteria of Bifidobacterium longum， Lactobacillus acidophilus and Enterococcus faecalis in each capsule were all more than 1×107 CFU when they were incubated for 7 days at 25， 30 and 37 ℃. The number of the living bacteria and their survival rates were the highest when capsules were stored under 25 ℃. The number of B. longum was significantly higher when cultured on blood medium than the other media tested， which indicated that the blood medium was more suitable for the growth of B. longum.

KEy WORDS Bifico capsules； storage temperature； medium

培菲康胶囊（Live Combined Bifidobacterium， Lactobacillus and Enterococcus Capsules）作为一种复合微生态制剂，包含长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌三种主要益生菌，可通过补充这些益生菌促进宿主肠胃增殖新生益生菌，从而在重建宿主肠道菌群、保证肠道微生态平衡、提高机体免疫力、促进宿主健康中发挥着重要作用。它在临床广泛应用于儿童腹泻、儿童功能性便秘、新生儿黄疸、肠易激综合征等疾病的治疗，对儿童厌食症、肝硬化、幽门螺旋杆菌感染、儿童单纯性肾病综合征等也有很好的疗效。

活菌数作为一种可有效考察微生态制剂有效性的质量控制指标，也是稳定性考察的重要指标。目前研究表明保藏温度[1-4]、保藏时间[5-6]、培养基类型[5-6]、pH[2，4]及抗生素添加[4，7]是影响微生态制剂活菌数的主要因素。为了对培菲康三元复合制剂中长双歧杆菌进行准确计数，排除嗜酸乳杆菌和粪肠球菌的干扰，需要在培养基中添加四环素抑制其他两种菌的生长，而长双歧杆菌对四环素不敏感；尽管培菲康推荐保藏温度为4 ℃，但考虑到患者用药的实际情况，我们还考察25、30、37 ℃条件下短期保存的活菌数变化情况，以便准确判断以上因素对微生态制剂活菌数的影响，为进一步优化微生态制剂的生产工艺，提高制剂中的活菌数及产品稳定性提供有效依据[8]。

1 材料与方法

1.1 菌株及试剂

试验菌株来自微生态制剂培菲康胶囊，是由长双歧杆菌菌粉、嗜酸乳杆菌菌粉、粪肠球菌菌粉按照一定比例混合而成的微生态制剂，三种单菌粉和胶囊均来自上海上药信谊药厂有限公司制药总厂培菲康车间；培养基为厌氧稀释液、MRS培养基、血平板培养基、普通营养琼脂培养基、GAM培养基（批号20150215，青岛日水生物技术有限公司；批号290409，日本日水製薬株式会社）；四环素（批号10015839，Sigma公司；批号130306-201419，中檢院标准品）。

1.2 试剂和培养基配制

1）厌氧稀释液 胰酪胨20 g，酵母粉10 g，葡萄糖0.5 g，CaCl2 8 mg，MgSO4 8 mg，KH2PO4 40 mg，L-半胱氨酸盐酸盐1 g，定容至1 L，pH 7.4，115 ℃湿热灭菌30 min；

2）MRS培养基 MRS agarose 62 g粉末溶于1 L纯化水，121 ℃湿热灭菌15 min；

3）血平板培养基 牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，胰酪胨3 g，酵母提取物5 g，葡萄糖10 g，大豆胨10 g，可溶性淀粉0.5 g，吐温1 ml，猪肝浸出液170 ml，KH2PO4 2 g，K2HPO4 2 g，MgSO4 0.4 g，FeSO4·7H2O 20 mg，NaCl 20 mg，MnSO4 13 mg，L-盐酸半胱氨酸1 g，琼脂17 g，用纯化水定容至1 L，调节pH 7.4，115 ℃湿热灭菌30 min；

4）普通营养琼脂培养基 称取营养琼脂菌粉36 g粉末溶于1 L纯化水，121 ℃湿热灭菌15 min；

5）GAM培养基 称取76 g溶于1 L去离子水中，115 ℃灭菌 30 min

6）四环素溶液 用去离子水配制100 mg/ml的四环素溶液10 ml，溶解摇匀，用0.22 mm的滤膜过滤灭菌后保存于4 ℃。

1.3 主要试验设备

IMH180高端型微生物培养箱和RI-150低温培养箱（美国赛默飞公司）；KB23低温培养箱（德国本德尔公司）；YXQ-LS-50SII立式压力蒸汽灭菌器（上海博讯医疗设备有限公司）；SW-CJ-2D双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 不同存放温度对活菌数的影响

将培菲康胶囊分别放置于25、30、37 ℃恒温生化培养箱中，于存放第1、3、7天各取3粒胶囊，将其菌粉溶解于厌氧稀释液，充分摇匀，10倍梯度稀释后，取稀释液100 ml涂布装有固体培养基的3个平皿，置37 ℃培养（长双歧杆菌于厌氧环境培养）48 h，镜检无杂菌，计算活菌数，并以空白组为对照。

1.4.2 不同培养基对活菌数的影响

分别取长双歧杆菌菌粉3 g，混合菌粉5.5 g，加无菌生理盐水27 ml，混匀。梯度稀释至10-6、10-7，取100 ml涂布于GAM和血平板培养基，于37 ℃厌氧培养7 d，镜检无杂菌，计算活菌数。同法将菌液涂布于含不同来源四环素的平皿，考察其对菌落计数的影响。

1.5 统计分析

利用Excel 2019和SPSS 23数据处理软件对试验数据进行分析。

2 结果

2.1 温度对菌株的影响

培菲康胶囊于25、30、37 ℃放置7 d后，每粒胶囊所含长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌活菌数均大于1×107 CFU，符合《中国生物制品规程》要求。随着放置时间的增长，培菲康胶囊中的长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌活菌数在3种存放温度条件下都会下降，温度越高，活菌数下降的程度越大。相比较而言，三种菌株于25 ℃存放的存活率最高（表1）。

2.2 含或不含四环素培养基对菌粉中长双歧杆菌活菌数的影响

结果表明，长双歧杆菌对四环素不敏感，培养基含不含四环素对单菌粉活菌量影响不明显；混合菌粉中长双歧杆菌活菌数低于单菌粉计数，两者具有显著性差异，混合菌粉中长双歧杆菌的存活率受嗜酸乳杆菌和粪肠球菌的影响，其在添加四环素的培养基中活菌数高于不含四环素的培养基，低于单菌粉的活菌数，说明其他两种菌在培养过程中对长双歧杆菌有一定的抑制作用，因此后续培养基及四环素对活菌数影响的实验采用单菌粉进行计数更为有效（表2）。

在血平板、GAM日本日水、GAM青岛日水三种培养基条件下培养，未添加四环素和添加有中检院盐酸四环素的长双歧杆菌活菌计数均呈现出血平板培养基中活菌数最高，与日水培养基差异明显，GAM日本日水培养基中培养的活菌数高于GAM青岛日水平培养基，但差异不明显。表明采用血平板检测混合菌粉中的活菌数更准确（表2）。

2.3 不同来源四环素对活菌数的影响

Sigma盐酸四环素与中检院盐酸四环素（质量浓度均为100 mg/ml）对长双歧杆菌计数的影响不同。与未添加四环素培养基中活菌数相比，添加有四环素（Sigma）的培养基中，长双歧杆菌的活菌数数量减少了大约100倍；而在添加四环素（中检院）的培养基中，长双歧杆菌的活菌数数量减少了不到10倍（表3），说明了长双歧杆菌对两厂商四环素的敏感性存在一定的差异。

3 讨论

多元复合活菌制剂中对目标菌种的计数具有较高的难度，既要抑制非目标菌种的生长又要保证目标菌种的正常生长，而在计数培养基中添加适量的抗生素是最长用的方法之一。培菲康为三元混合活菌制剂，长双歧杆菌作为主要益生菌之一，其对不同培养基有不同的适应性。本研究中，长双歧杆菌在血平板培养基中培养具有较高的活菌数，在进口或国产的GAM培养基中活菌数都较低，说明血平板培养基中所含的营养成分更适合长双歧杆菌的生长。研究也表明长双歧杆菌对不同来源四环素具有不同的耐受性，本研究中同一种培养基种添加不同品牌的四环素，长双歧杆菌活菌数也表现出明显差异性，其中Sigma盐酸四环素对长双歧杆菌活菌数具有较大影响，说明在实际运用中，应多加考虑抗生素品牌、效价及保存期等多种因素。

本研究表明影响培菲康胶囊中活菌数检测的主要因素有贮存温度、培养基及抗生素。考虑患者的实际情况，短途运输或短时间非正常情况保存的条件下长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌和粪肠球菌的活性稳定性，通过试验说明在25 ℃条件下培菲康胶囊具有更好的稳定性，活菌维持更高。血平板培养基更适于混合菌粉中长双歧杆菌活菌量的检测。长双歧杆菌对不同厂家抗生素——四环素的敏感性存在一定的差异。同浓度抗生素对活菌量影响差异的出现，是否是不同厂家抗生素存在效价差异或菌体自身抗性的不同，还有待进一步的研究。

参考文献

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