HPLC法指纹图谱在山慈菇真伪鉴别中的应用

杨红燕 项微微 李玲燕

台州市中医院 浙江 台州318000

山慈菇为兰科植物杜鹃兰、独蒜兰或云南独蒜兰的干燥假鳞茎。前者习称“毛慈菇”，后二者习称“冰球子”，为中国的特有植物。分布在中国大陆的广西等地，生长于海拔960米至1200米的地区，多生于山坡林下及溪边阴湿地，目前尚未有人工引种栽培。其味甘、微辛、性凉，归肝、脾经，具有清热解毒、化痰散结的功效，主要用于痈肿疔毒、瘰疬、蛇虫咬伤等症[1]。据文献报道[2]，目前能从山慈菇中分离得到60 个单体化合物，对治疗肿瘤具有较好的疗效。

作为价格比较高的山慈菇，存在着掺假现象，尤其是粉末。笔者曾对浙江省山慈菇饮片质量情况进行调查分析，共收集浙江省11个市涉及35家生产企业的87批次样品，涉及生产、经营及医疗各行业单位。按《中国药典》2015 年版一部法定标准性状鉴别和显微鉴别进行检验，结果发现合格率仅为82.8%，而伪品大多数为山兰、扁白及等山慈菇同科品种。《中国药典》仅只有性状、显微鉴别与SO2残留三项检查，尚无相关专属性鉴别方法和定量标准。由于现行质量标准检验项目设置过于简单，且尚无山慈菇专属性鉴别方法和定量标准，对于切片加工后的饮片鉴别方面仍存在一定的局限性。中药指纹图谱是一种从整体上对中药进行鉴定和评价的技术，为中药质量评价建立了重要的模式，已经成为国内外公认的控制中药材和天然药物质量最有效的方法，被更多人采纳。因此本文拟通过建立山慈菇高效液相色谱法（HPLC）指纹图谱，对其相关指标成分进行含量测定，以此直观判断山慈菇药品的真伪，为进一步提高山慈菇质量水平提供一定的参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器：Waters e2695 液相色谱仪（美国沃特世公司，2998 PDA 检测器和Empower2 色谱工作站），BP221S型电子天平（德国赛多利斯），恒温水浴锅（江苏金坛市江南仪器厂）。

1.2 试剂与材料：乙腈为色谱纯，磷酸、甲醇、乙醇、氨水均为分析纯，水为去离子水。10 批山慈菇（冰球子）样品性状经台州市药品检验研究院中药检验所鉴定，均符合《中国药典》2015年版一部规定。

2 方法与结果

经查阅相关文献[3-6]，并经过液相条件的摸索，按照高效液相色谱法（《中国药典》2015 年版四部0512），拟建立如下HPLC指纹图谱方法。

2.1 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）为流动相；检测波长为224nm。理论板数按1，4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯（militarine）峰计算应不低于2000。

2.2 供试品溶液的制备：取本品粉末（过四号筛）1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇100ml，浸泡1 小时，然后超声处理（功率240W，频率45kHz）1 小时，放冷，用干燥滤器过滤，残渣用70%甲醇淋洗后合并，将滤液浓缩并转移到20ml 量瓶中，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 测定法：分别精密吸取各供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

在以上液相条件下，得到山慈菇（冰球子）及各类样品的HPLC 指纹图谱，见图2。得到共有峰7 个，经过对照品比对，指认含量最高的峰为militarine，作为参考峰。相似度均大于0.990（见图1）。

2.4 指纹图谱方法学考察：分述如下。

2.4.1 精密度实验：取同一供试品溶液（样3），按“2.3”项下方法连续进样6次，记录特征图谱。将测量结果采用国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统（2004 A 版）”软件处理，结果表明，其相似度均＞0.95，符合特征图谱技术要求，精密度良好。

2.4.2 重复性试验：取同一样品（样3）6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下方法进样测定。将测量结果采用国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统（2004 A 版）”软件处理，结果表明，其相似度均＞0.95，符合特征图谱技术要求，重复性良好。

2.4.3 稳定性试验：取同一样品（样3）溶液在0、4、12、24h 分别进样，依法测定。将测量结果采用国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统（2004 A 版）”软件处理，结果表明，其相似度均＞0.95，表明样品供试品溶液在24h内检测结果无影响，稳定性良好。

图1 山慈菇（冰球子）HPLC指纹图谱

3 山慈菇HPLC指纹图谱在真伪鉴别中的应用

中药材市场上山慈菇的伪品较多，较难鉴别，因此建立了冰球子及其伪品白及、山兰、扁白及的HPLC 图谱，比较指标成分Militarine 的峰值大小，并通过其它相似性分析，可以很好地对冰球子及其伪品白及、山兰、扁白及的来源进行鉴别，详见图2。

4 讨论

militarine 成分为山慈菇及其伪品山兰共有成分，但含量却有所差别，本课题比较了10个批次山慈菇（冰球子）中militarine 的含量，建立了山慈菇HPLC 指纹图谱。而HPLC 指纹图谱的建立，则可以为毛慈菇、冰球子及伪品白及、山兰、扁白及的来源鉴别提供一定的依据，从而可以直观地鉴别山慈菇药品的真伪。本文虽采用HPLC 法建立特征指纹图谱，却只测定了其中一个指标成分的含量，没有测定多个指标成分的含量，不能从整体上评价药材的质量，且没有研究考察不同年份、不同产地、不同采收期山慈菇各指标成分的动态变化，会影响特征指纹图谱的重现性，因此在后期的相关研究中，笔者会在本研究基础上，对山慈菇的质量控制进行更深层次的探索。

图2 冰球子及其伪品的HPLC图谱