体外产气法评价发酵桑叶对湖羊瘤胃发酵参数的影响

罗阳　何芳　浣成　李昊帮　孙鏖　李剑波　李晟　易康乐

摘要：【目的】研究发酵桑叶在湖羊瘤胃中的产气效果及降解率，为发酵桑叶的推广应用提供理论基础。【方法】选用苜蓿和羊草作为试验对照，采集3头健康成年湖羊瘤胃液，利用体外产气法评估发酵桑叶在瘤胃中48h内的产气发酵参数。【结果】发酵桑叶48h体外产气总量为187.25mL·g-1，与苜蓿体外产气总量差异不显著（P>0.05），但极显著高于羊草（P<0.01）;发酵桑叶总可挥发性脂肪酸浓度为46.78mmol·L-1，极显著高于羊草组（P<0.01）;其中发酵桑叶的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸和异戊酸浓度分别为29.76、10.18、4.12、1.54、0.48和0.70mmol·L-1，除丙酸外，其他酸浓度均显著高于羊草（P<0.01）;其中丁酸和戊酸浓度显著高于苜蓿（P<0.01）。发酵桑叶、苜蓿和羊草发酵液中氨态氮（NH3·N）含量分别为1.03、1.75和0.71mmol·mL-1，组间差异极显著（P<0.01）;发酵桑叶的乙酸丙酸比值为2.2，极显著高于苜蓿和羊草（P<0.01）;发酵桑叶的干物质降解率为46.76%，极显著低于苜蓿和羊草（P<0.01），中性洗涤纤维降解率为70.25%，极显著高于苜蓿和羊草（P<0.01）。【结论】发酵桑叶能促进反刍动物瘤胃产气发酵，可以在反刍动物饲料中应用推广。

关键词：发酵桑叶;瘤胃发酵;湖羊;体外产气法

中图分类号：S816.6

文献标志码：A

文章编号：1008-0384（2020）11-1258-07

0引言

【研究意义】桑叶（Morus albaL.）具有抗氧化、降血脂、增强机体免疫力等生理功能[1-4]。据报道，桑叶的氨基酸组成均衡，富含黄酮类（flavonoids）、生物碱（alkaloids）、多糖（polysaccharide）等生物活性物质[5]，饲用价值较高，在现代农业中桑叶逐渐被家畜饲料化。将桑叶制成桑叶粉是饲料工业中常用的加工技术，研究顯示桑叶粉可以提高育肥猪的日增重和提升蛋鸡生产性能和鸡蛋品质[6-7]。由于桑叶良好的饲喂效果，使其成为一种新型的饲料资源，为缓解我国人畜争粮、蛋白质饲料资源短缺等问题提供新的思路和途径。【前人研究进展】成熟的桑叶粗纤维含量较高，且含有植酸、单宁等抗营养因子，在反刍动物饲料中降低了鲜桑和桑叶粉的饲用价值[8-9]。微生物的发酵作用能有效缓解抗营养因子对动物消化吸收的影响，提高黄酮类化合物的利用效率，实现桑叶中生物活性成分的修饰和优化[10-11]。有研究认为桑叶与反刍动物常用粗饲料存在正组合效应，能加快瘤胃降解速度，提高瘤胃液中优质蛋白质的含量，促进反刍动物的生长性能[12-13]。本团队前期的研究发现，添加发酵桑叶对杂交育肥牛的屠宰性能.肌肉品质具有一定的促进作用，能提高动物机体的抗氧化和免疫能力，促进肌肉中氨基酸和脂肪酸的沉积[14-15]。【本研究切入点】但发酵桑叶对瘤胃内环境发酵的影响未见相关研究报道。【拟解决的关键问题】本试验以羊草和苜蓿为对照，利用体外产气法评定发酵桑叶在反刍动物饲料中的利用价值，为发酵桑叶的推广利用提供更多的参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料

新鲜桑叶由湖南省某桑叶种植基地提供，经铡草机粉碎成2cm左右的碎屑后，按照1：105质量比添加青贮宝（主成分乳酸片球菌、植物乳杆菌及其代谢产物，购自湖南佳牛牧业有限公司）和2%的白砂糖，用网捆青贮裹包机进行密封，置于阴凉处自然发酵40d（环境温度约25～30℃），发酵好的桑叶无霉变，呈黄绿色、散发酸香味。供试羊草和苜蓿由湖南省奶牛原种场提供。所有样本经65℃烘干后，用高速万能粉碎机（FW135型）粉碎后过40目筛，4℃冷库保存备用。

1.2试验动物

3头健康状况良好且装有永久性瘤胃瘘管的成年湖羊由浙江大学动物科学学院提供。

1.3试验设计

本试验设置3个组，发酵桑叶为试验组，标准干草苜蓿和羊草作为对照组，每组样品5个重复，采用压力读取式体外产气技术（RPT） [16]评估发酵桑叶对瘤胃发酵的影响，设定3个空白组不加底物用于校正。测定第2、4、6、9、12、24、36、48h产气瓶内的压力值。

1.4发酵液配制

1.4.1发酵液原液 A、微量元素溶液：CaCl2·2H2O（分析纯）13.2g、MnCl2·4H2O（分析纯）10.0g、CoCl2·6H2O（分析纯）1.0g、FeCl3·6H2O（分析纯）8.0g、加蒸馏水定容至1000 mL;B、缓冲液：NH4HCO3（分析纯）4.0g、NaHCO3（分析纯）35.0g、加蒸馏水定容至1000mL;C、常量元素溶液Na2HPO4·12H2O（分析纯）9.45g、KH2PO4（分析纯）6.2g、MgSO4·7H20（分析纯）0.6g、加蒸馏水定容至1000mL;D、0.1%刃天青溶液：100mg刃天青溶解于100mL蒸馏水;E、还原剂溶液（现用现配）：1mol·L-1NaOH（分析纯）4.0mL;Na2S·9H2O（分析纯）625mg加95mL蒸馏水。

1.4.2人工唾液配置 取蒸馏水520.3mL、缓冲液208.1mL、常量元素溶液208.1mL、微量元素溶液0.1mL、0.1%刃天青溶液1mL、还原剂溶液62.4mL共1000 mL，混匀后置于（39.0±0.5）℃恒温水浴锅内，连续通入CO2，使其由蓝色转变为粉红色，最终为无色。

1.5测定指标和方法

1.5.1常规营养成分测定 饲料样品中干物质（DM）的测定参照国家标准（GB/T 6435-2014）、粗脂肪（EE）含量的测定参照国家标准（GBIT6438-2007）、粗蛋白质（CP）采用凯氏定氮法（GB/T 6432-2018）进行测定，中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）的含量利用VanSoest氏法测定[17]。

1.5.2体外产气量测定 晨饲前采集湖羊瘤胃液于保温杯中，混匀后经4层纱布过滤与9倍体积的人工唾液混合[18]，得到人工瘤胃液。在120mL产气瓶加入0.5g（DM）样品，放入厌氧培养箱（M2000，美国Coylab公司）中除去氧气，注入50mL的人工瘤胃液，取出置于（39.0±0.5）℃隔水式恒温培养箱连续培养48h。在2、4、6、9、12、24、36、48h时利用压力传感器分别读取产气瓶内的压力值，经空白校正后，按以下公式转换成产气体积：

GPt= Pt×（Vo-50）/（101.3×W）

式中，GPt为底物在t时间段内的产气量，mL;Pt为t时间段读取的压力值，kPa; Vo为产气瓶体积，mL;101.3为标准大气压，kPa;W为底物干物质质量，kg;产气过程的累计产气量为各时间段的产气量之和。

1.5.3挥发性脂肪酸（Volatile fatty acid，VFA）及pH值的测定 产气结束后，取1mL发酵液，加入50μL85%的正磷酸，4℃条件下20000g离心10min，取上清液置于4℃冰箱中备用，用气相色谱仪（GC-2010，日本Shimadzu公司）测定发酵液中乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸的含量。利用便携式pH计（PB-IO，德国Sartorius公司）测定发酵液的pH值。

1.5.4氨态氮（NH3·N）浓度及CH4含量测定 取5mL体外发酵培养液，3500g离心10min，取上清，以氯化铵为标准品，用可见分光光度计（721型）于700nm波长条件下测定NH3·N的浓度。用大剂量气体进样器吸取1.2mL气体样品，用气相色谱仪分析气体中CH4的含量。

1.5.5体外营养物质消化率测定 体外培养结束后，发酵液经10000g离心10min，弃上清液，剩余残渣经65℃烘干24h后称重，测定计算体外干物质降解率（IVDMD）、中性洗涤纤维降解率（IVNDFD）和体外酸性洗涤纤维降解率（IVADFD）。

1.6数据分析

原始数据经Excel 2007初步处理后，用SPSS20.0进行单因子方差分析（one-way ANOVA，LSD）和Duncan's多重比较，结果用平均数±标准差表示。

2结果与分析

2.1发酵桑叶常规营养成分分析

由表1可知，羊草的干物质含量最高，为93.60%，其次是苜蓿（92.45%）、发酵桑叶（90.86%），3种饲料DM含量差异极显著（P<0.01）;发酵桑叶、苜蓿、羊草蛋白质分别为16.67%、13.18%和5.39%，组间差异极显著（P<0.01）;发酵桑叶粗脂肪为16.54%，极显著高于苜蓿和羊草（P<0.01）;NDF含量从高到低为发酵桑叶（69.05%）>苜蓿（54.29%）>羊草（41.34%），组间差异极显著（P<0.01）;羊草酸性洗涤纤维含量显著高于发酵桑叶和苜蓿（P<0.01）;苜蓿草Ca含量高于发酵桑叶和羊草，组间差异极显著（P<0.01）;但发酵桑叶、苜蓿和羊草P含量无显著性差异（P>0.05）。

2.2发酵桑叶、苜蓿和羊草产气分析

由表2可知，48h产气结束后，发酵桑叶和苜蓿累计产气量为187.25、177.08mL·g-1，极显著高于羊草（P<0.01）;产气前12h，发酵桑叶的产气速率最快，极显著高于苜蓿和羊草（P<0.01）;在产气前6h羊草的累计产气量极显著高于苜蓿（P<0.01），6～48h苜蓿的累计产气量极显著高于羊草（P<0.01）。

2.3发酵桑叶、苜蓿和羊草48h发酵参数分析

由表3可知，整个产气阶段发酵桑叶和羊草的甲烷产量高于苜蓿，但差异不显著（P>0.05）;3种饲料发酵液pH值无显著差异（P>0.05）。发酵桑叶和苜蓿的总挥发性脂肪酸（TVFA）为46.78、49.80mmol·L-1，极显著高于羊草（P<0.01）;其中发酵桑叶的乙酸产量为29.76mmol·L-1，与苜蓿差异不显著（P>0.05），但显著高于羊草（P<0.05）;发酵桑叶丙酸产量为10.18mmol·L-1，与羊草差异不显著（P>0.05），但极显著低于苜蓿（P<0.01）;异丁酸和异戊酸的产量由高到低依次为：苜蓿>发酵桑叶>羊草，组间差异极显著（P<0.01）;丁酸和戊酸的产量由高到低依次为：发酵桑叶>苜蓿>羊草，組间差异极显著（P<0.01）。发酵桑叶、苜蓿和羊草48h发酵液中氨态氮（NH3·N）含量分别为1.03、1.75和0.71mmol·mL-1，组间差异极显著（P<0.01）;发酵桑叶的乙酸丙酸比值为2.92，极显著高于苜蓿和羊草（P<0.01）。

2.4发酵桑叶、苜蓿和羊草体外营养物质降解率分析

由表4可知，发酵桑叶的体外干物质降解率为46.76%，显著性低于苜蓿和羊草（P<0.01）;其中性洗涤纤维降解率为70.25%，极显著高于苜蓿和羊草（P<0.01）;酸性洗涤纤维降解率为34.92%，极显著高于苜蓿，极显著低于羊草（P<0.01）。

3讨论

3.1发酵桑叶常规营养成分分析

桑树已被农业农村部列为饲料目录，尤其对反刍动物具有良好的适口性，成为非常规饲料开发的关注焦点。在本试验中，发酵桑叶的CP、EE、DNF和ADF含量分别为16.67%、16.54%、69.05%和23.87%，虽然未检测新鲜桑叶的营养成分，但经查阅文献发现，新鲜桑叶CP含量为13.61%～24.97%，EE含量为4.00%～10.00%，NDF含量为21.50%～35.66%，ADF含量为16.00%～24.13%[19-21]。除了CP和ADF外，发酵后桑叶的EE和NDF都高于鲜桑叶的含量范围，这可能是由于微生物发酵对EE和NDF的含量产生了影响，胡仁建等[22-24]也发现青贮发酵能够提高桑叶EE和NDF的含量。本试验结果显示，发酵桑叶的CP、EE和NDF含量均高于苜蓿和羊草，CP和EE分别能够提供氮源和能量，对维持瘤胃内环境和微生物生长极为重要，而NDF对动物的干物质采食量和饲料消化率有重要影响[25-26]。从营养成分数据来看，发酵桑叶适合作为反刍动物的饲料来源。

3.2发酵桑叶对瘤胃体外产气量的影响

产气量反映饲料可发酵程度及瘤胃微生物的活性，饲料的营养价值越高，微生物的发酵活性越强，产气量也越高[27]。本试验研究发现，发酵桑叶的总产气量与苜蓿差异不显著，但显著高于羊草，而且在发酵前期产气速率最快，这可能是由于发酵桑叶自身的营养物质组成有关。李文娟等[28]研究發现，桑叶中非结构性碳水化合物含量高于其他牧草;Russell等[29]认为瘤胃发酵速率与非结构性碳水化合物含量呈正相关;张桂杰等[30]也发现非结构性碳水化合物与瘤胃体外产气延滞时间具有相关性。本研究数据预示瘤胃微生物能够对发酵桑叶的进行快速降解，利于反刍动物消化道的吸收利用。

3.3发酵桑叶对瘤胃发酵参数的影响

正常瘤胃液的pH值范围为5.5～6.8，它反映瘤胃发酵水平和瘤胃内环境的稳态。试验中发酵桑叶、苜蓿和羊草发酵液的pH值差异不显著，且都在瘤胃的正常pH值范围之内，说明发酵桑叶对瘤胃酸碱内环境未造成不良影响。甲烷的产生会造成瘤胃发酵能量的损失，并通过暖气排泄造成温室效应。在本试验中，发酵桑叶与苜蓿、羊草的甲烷产量差异不显著，说明发酵桑叶对甲烷减排效果与苜蓿、羊草相当。VFA是饲料中碳水化合物发酵的主要产物，是反刍动物机体主要能量来源[17]。本试验中，发酵桑叶和苜蓿的TVFA差异不显著，但显著高于羊草，发酵桑叶的乙酸、丙酸产量显著低于苜蓿，可能是由于发酵桑叶的能量比苜蓿低[21]，与王文基等[31]的研究结果一致。NH3·N是合成微生物蛋白的重要原料，是评判瘤胃微生物蛋白质代谢的重要指标之一[32]。本试验结果显示，发酵桑叶NH3·N显著性低于苜蓿，但高于羊草，说明发酵液中的NH3·N浓度与饲料营养物质含量相关，由于桑叶中富含黄酮，可能会对瘤胃NH3·N浓度产生影响;王梦竹等[33]认为黄酮类化合物可以显著提高瘤胃发酵液中NH3·N的浓度，而包玲玲等[34]认为黄酮化合物能降低瘤胃中NH3·N的浓度，这有可能是本试验发酵桑叶NH3·N浓度低于苜蓿的原因。因此，发酵桑叶对瘤胃液中NH3·N的影响还需要进一步验证。

3.4发酵桑叶对体外降解率的影响

干物质降解率是反映饲料在消化道降解程度的指标。本试验中发酵桑叶的IVDMD低于羊草和苜蓿，与王雯熙等[21]的研究结果不一致，可能是与瘤胃IVDMD的测定指标差异较大有关[35]。发酵桑叶的IVNDF高于羊草和苜蓿，可能是因为桑叶NDF的含量高于苜蓿和羊草，而瘤胃对其具有同等的降解能力。

4结论

发酵桑叶营养成分含量高，营养价值与苜蓿相当，能促进瘤胃产气发酵，在反刍动物饲料中有较好的应用前景。

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（责任编辑：张梅）

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收稿日期：2020-06-17初稿：2020-09-25修改稿

作者简介：罗阳（1988-），男，硕上，助理研究员，研究方向：反刍动物营养与饲料（E-mail：xinhelu509@163.com）

*通信作者：易康乐（1980-）男，博上，研究员，研究方向：动物繁殖（E-mail： 23404504@qq.com）

基金项目：国家重点研发计划项目（2018YFD050170）;湖南省科技重大专项（2017NKl020）