东乡野生稻苗期耐冷QTL qCTS11.2位点候选基因LOC_Os11g35390-DX的克隆、生物信息学分析及遗传转化

张进兵 沈春修 王舸泓 廖建平 却志群

关键词：东乡野生稻;耐冷;数量性状座位（Quantitative trait locus，QTL）;转录组分析;半定量RT-PCR

中图分类号：S511.01文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）06-1612-05

Key words：Dongxiang wild rice;cold tolerance;quantitative trait locus （QTL）;transcriptome analysis;semi-quantitative RT-PCR

低温寒害是影响水稻生产的主要不利因素之一，特别是苗期对低温胁迫尤为敏感，早春时期的水稻秧苗暴露于低温胁迫下，幼苗发育变缓、变黄、枯萎，最终导致水稻产量下降[1]。受低温逆境胁迫的影响，东南亚和南亚共约有7.00×106 hm2土地无法种植水稻[2]。在中国，除了纬度较高的东北水稻耕作区易受低温影响外，长江中下游地区早春时期的“倒春寒”常导致水稻烂根、烂秧，对水稻产量产生了严重影响。据统计，每年中国稻作区均有低温冷害发生，平均4～5年发生1次严重冷害，造成水稻灾年年均减产5.0×109～1.0×1010 kg[3]。挖掘水稻自身的耐冷相关基因，培育强耐冷性水稻品种是解决当前生产上这一突出问题的重要途径。

据国家水稻数据中心（http：//www.ricedata.cn/）统计，截至2020年2月1日，水稻中已被克隆的耐冷相关基因共计81个，其中占比最大的一类是转录因子基因，约占50%，当遭遇冷胁迫时，植物转录因子的表达被启动，然后激活下游一系列抗寒功能性基因的表达，从而提高了植物的抗寒性[4-5]。由此可见，耐冷相关转录因子基因在未来水稻抗寒育种中有着广阔的应用前景。MYB（V-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）转录因子基因家族是目前植物中已知基因数最为庞大的转录因子基因家族之一。MYB转录因子由其N端保守的DNA结合结构域而得名，根据结构域中不完全重复的R结构的数量，可将MYB转录因子分为4个亚类：单一R结构的MYB、R2R3型MYB、3R-MYB及4R-MYB。此外，有较多研究发现MYB转录因子广泛参与了植株耐低温胁迫的基因转录调控网络[6-8]。自东乡野生稻被发现以来，一直以耐冷性强而著称，然而目前在东乡野生稻中还未见关于MYB转录因子在低温逆境胁迫中发挥作用的报道。

笔者所在课题组前期通过对耐冷东乡野生稻、茶陵野生稻、东乡野生稻与冷敏感水稻93-11杂交所得F2代越冬群体（OOP，由20个典型的可越冬存活的F2代个体组成）及冷敏感水稻93-11苗期冷处理（4 ℃ 3 d）前后的转录组数据进行比较分析，获得了462个与水稻苗期耐冷性相关的差异表达基因（Different expressed genes， DEG）[9]，结合Mao等公布的13个东乡野生稻苗期耐冷数量性状QTL信息[10]，发现有1个差异表达基因LOC_Os11g35390刚好落于QTL的qCTS11.2位点区域。本研究将东乡野生稻中该差异表达的基因暂命名为LOC_Os11g35390-DX，并将该基因视为耐冷QTL的qCTS11.2基因的候选基因，擬通过半定量RT-PCR技术验证该基因在东乡野生稻冷胁迫前后表达量的变化，克隆以该基因为中心的上下游各延伸约1.2 kb的基因片段，并预测分析该基因的上游潜在功能顺式元件，最后借助农杆菌介导的方法转化冷敏感水稻受体品种明恢86。本研究结果可为后续东乡野生稻耐冷基因在耐低温胁迫功能中的研究奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

供试植物材料为东乡野生稻，受体材料为冷敏感水稻品种明恢86，2种水稻材料均由笔者所在实验室保存。大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌菌株EHA105均购自北京全式金生物技术有限公司。植物表达载体pCAMBIA1300由笔者所在实验室保存。

RNA抽提试剂盒，购自成都福际生物技术有限公司;高保真DNA聚合酶、Fast Pfu DNA聚合酶、RT-PCR试剂盒，均购自TransGen公司;质粒抽提试剂盒，购自OMEGA公司;限制性内切酶BamHⅠ、Kpn Ⅰ，购自Thermo公司;rTaq DNA聚合酶，购自TaKaRa公司。其余试剂均为国产或进口分析纯级别。

1.2方法

1.2.1引物的设计根据Rice Genome Annotation Project（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）中公布的水稻LOC_Os11g35390基因及其上游序列信息，使用Primer 5.0软件设计基因扩增引物35390-DX-F、35390-DX-R，参照外显子序列设计半定量RT-PCR引物SQU-35390-F、SQU-35390-R，Tubulin-F、Tubulin-R为内参基因Tubulin的扩增引物，Hpt-F、Hpt-R为潮霉素抗性标记基因的扩增引物。

1.2.2荧光定量表达分析参照TIANGEN公司的Super Real PerMix Plus（SYBR Green）试剂盒操作方法说明，以SQU-35390-F、SQU-35390-R为引物，在StepOne PlusTM荧光定量PCR仪中进行实时荧光定量PCR扩增，用△△Ct分析方法评估基因的表达水平。将东乡野生稻幼苗在常温条件（28 ℃左右）下培养至4周左右后置于4 ℃冷藏柜中进行冷处理，以处理前的东乡野生稻叶片样本作为对照组，将东乡野生稻于4 ℃冷处理1 d、2 d、3 d后的叶片样本作为试验组，以微管蛋白（Tublin）编码基因作为内参基因，设置3次生物学重复和3次技术重复。

1.2.3遗传转化用农杆菌介导的转化方法将构建好的植物表达载体pCAMBIA1300-35390-DX导入转基因受体水稻品种明恢86中，在转基因过程中，培养基的配制参照魏林艳[11]的方法。

1.2.4耐冷性的鉴定待来源于T0代转基因株系的T1代水稻种子发芽后，将其置于盛有50 mg/L潮霉素溶液的培养皿（直径为90 mm）中，进行约10 d的筛选培养，选择生长不受抑制的T1代转基因植株与同时进行发芽处理的受体明恢86植株（在盛有灭菌水的培养皿中培养）移栽到同1个盛有泥土的塑料培养容器中（19 cm×13 cm×12 cm）。采用自然光照射，平均昼夜温度为28 ℃至22 ℃，每天对幼苗浇水直至3～4叶期，而后将幼苗移栽至4 ℃的环境中，进行2～3 d的冷处理。复活10 d后分别统计野生型植株、转基因植株的复活率（复活率=处理后复活幼苗数/幼苗总数×100%），试验设3次重复。

1.2.5生物信息学分析用生物信息学软件PlantCARE分析启动子序列，预测其中存在的顺式元件;用在线分析软件SMART对基因编码蛋白质的结构域进行预测分析;用DNAMAN进行氨基酸序列的多重比对和系统进化树的构建。

2结果与分析

2.1QTL qCTS11.2位点候选基因LOC_Os11g35390-DX的确定

根据Mao等[10]公开的东乡野生稻苗期耐冷QTL qCTS11.2位点最邻近侧翼标记的序列信息，在公共数据网站gramene（http：//ensembl.gramene.org/Tools/Blast）上对两端侧翼标记序列进行BLAST，以确认其在水稻染色体上的确切位置。随后在Rice Genome Annotation Project网站（http：//rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice）上输入这2个侧翼标记序列的物理位置信息，并查阅该区段中的所有基因，与笔者所在课题组前期通过RNA-seq测序统计发现的462个东乡野生稻和OOP共有的与耐冷相关的差异表达基因进行比对，最终发现在462个低温诱导的差异表达基因中有2个基因（LOC_Os11g31190-DX、LOC_Os11g35390-DX）位于qCTS11.2位点所处的染色体区段中，本研究选取的候选基因LOC_Os11g35390-DX正是其中之一。

2.2低温胁迫下东乡野生稻LOC_Os11g35390-DX基因的表達

在前期的研究中，笔者用RNA-seq技术对耐冷东乡野生稻苗期冷处理前后的转录组进行分析发现，东乡野生稻LOC_Os11g35390-DX基因的表达量在冷处理后显著下调，仅为冷处理前表达量的13.4%。这一结果显示，在东乡野生稻中，低温胁迫会诱导LOC_Os11g35390-DX基因表达量的下调。为了验证这一结论，用实时荧光定量PCR对东乡野生稻中的LOC_Os11g35390-DX基因在冷胁迫处理条件下的相对表达量进行分析。结果显示，在连续冷胁迫处理3 d的过程中，东乡野生稻中LOC_Os11g35390-DX基因的表达量表现出逐渐下调的趋势;冷处理3 d后，该基因的表达量下降至冷处理前表达量的7.8%。

2.3东乡野生稻LOC_Os11g35390-DX基因的克隆

对包含LOC_Os11g35390-DX基因及其上游、下游序列在内的共计4.5 kb的DNA片段进行PCR扩增。PCR扩增结果显示，扩增出的特异性条带与目的片段大小相符，约为4.5 kb。随后用BamH I、Kpn I限制性内切酶双酶切PCR扩增产物，用0.8%琼脂糖凝胶电泳后回收目的条带，与同样用BamH I、Kpn I限制性内切酶双酶切后的表达载体pCAMBIA1300进行连接。通过Bam H I、Kpn I双酶切鉴定重组克隆pCAMBIA1300-35390-DX，结果显示，本研究获得了1个阳性克隆，电泳所得大小约为9.0 kb的条带是pCAMBIA1300载体片段，大小约为4.5 kb的条带是目的基因片段。

2.4LOC_Os11g35390-DX蛋白结构域的分析及多重比对

通过对阳性克隆测序结果与公共数据库中水稻品种日本晴测序结果对应位点的全长cDNA序列进行比对，推测该基因全长cDNA大小为993 bp，编码330个氨基酸，使用生物信息学工具SMART对LOC_Os11g35390-DX蛋白氨基酸序列的保守结构域进行分析。结果显示，东乡野生稻LOC_Os11g35390-DX蛋白的N端有2个保守结构域SANT （SWI3， ADA2， N-CoR and TFIIIB DNA-binding domains），分别位于氨基酸序列第14～64号位点及第67～155号位点之间的区段，这一结构域是MYB转录因子典型的R2R3型保守结构域，表明东乡野生稻的LOC_Os11g35390-DX基因属于R2R3型MYB转录因子基因。从国家水稻数据中心网站（www.ricedata.com）上获取其他已克隆的水稻R2R3型MYB转录因子的氨基酸序列，使用DNAMAN将东乡野生稻LOC_Os11g35390-DX基因编码的蛋白质氨基酸序列与其进行多重比较，结果显示，东乡野生稻LOC_Os11g35390-DX基因编码的蛋白质氨基酸序列与OsJAMyb[12]、OsMYB2P-1[13]、OsMYB91[14]、OsMYB2[15]及OsMYB103[16]等R2R3型MYB转录因子基因编码的蛋白质氨基酸序列存在30.98%的一致性。

2.5水稻MYB转录因子基因分子进化树的构建

为了对东乡野生稻LOC_Os11g35390-DX基因的功能进行初步预测，用DNAMAN软件将该基因与19个已克隆的水稻MYB转录因子基因进行系统发育分析并构建进化树。结果表明，LOC_Os11g35390-DX基因与Osmyb4基因[17]、OsMYB30基因[18]同源性最高，亲缘关系最近;与水稻MYB1基因[19]、OsMYB6基因[20]的同源性最低，亲缘关系最远。

2.6重组质粒 pCAMBIA1300-35390-DX的遗传转化及T1代转基因植株耐冷表型的鉴定

将转入植物表达载体pCAMBIA1300-35390-DX的农杆菌菌株接种在含有50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平的LB固体平板上，培养2～3 d后侵染预备好的冷敏感水稻明恢86的愈伤组织，愈伤组织经与农杆菌克隆共培养，潮霉素筛选培养，分化培养基上的光照分化培养及幼苗生根壮苗后，最终获得24株转入重组载体pCAMBIA1300-35390-DX的转基因植株（图1）。用潮霉素抗性标记基因部分序列的特异性引物Hpt-F、Hpt-R对经潮霉素抗性筛选获得的T0代转基因水稻幼苗进行PCR扩增检测。结果显示，24个被检测植株中都检测到了目标条带，阳性率为100%，说明本研究已经获得转LOC_Os11g35390-DX基因的阳性株系。部分潮霉素抗性标记基因特异性引物的PCR检测结果显示，阳性样本在900 bp左右有目标条带，而野生型阴性对照无条带。本研究同时对来源于T0代转基因株系的T1代转基因植株与野生型水稻植株进行了耐冷表型的比较鉴定，然而未发现T1代转基因植株的耐冷性与野生型植株之间的耐冷性有明显差异。

2.7LOC_Os11g35390-DX基因上游启动子主要顺式作用元件的分析预测

本研究用启动子分析工具PlantCARE预测了LOC_Os11g3539-DX基因起始密码子上游约1.2 kb启动子序列中的主要顺式作用功能元件。结果表明，该顺式作用元件包含一些启动子的基本元件，包括3个转录起始核心顺式作用元件TATA-box位点、3个启动子结构以及增强子结构中常见的顺式作用元件CAAT-box位点。除了这些启动子的基本元件外，上游启动子序列还包含与非生物逆境胁迫有关的4个MYC转录因子结合顺式作用元件和1个MYB转录因子结合顺式作用元件，另外还携带一些与激素调控相关的作用元件，包括与茉莉酸信号通路相关的顺式作用元件GGTCA-motif、TGACG-motif，与脱落酸响应信号通路相关的顺式作用元件ABRE以及与生长素响应相关的顺式作用元件TGA-element。

3讨论

植物在生长发育过程中常受到各种逆境胁迫的影响，经过漫长的进化过程，植物受到逆境胁迫后，通过自身基因转录、转录水平的調控，形成了完整的抗逆境胁迫体系[21]。由此可见，与植物抗逆境胁迫相关的基因常为胁迫诱导表达基因，通过自身转录或翻译的变化，参与到植物抗逆境胁迫响应的机制中。通过QTL定位方法获得的QTL在染色体上的长度范围动辄达kb级，其中包含的基因数量巨大，无法实现基因的单独克隆鉴定、表型分析等工作，而缩小QTL定位范围又面临找寻分子标记难度逐步加大、工作量繁杂等问题。本研究结合Mao等[10]公开的东乡野生稻苗期耐冷QTL染色体位置信息，将低温处理（4 ℃处理3 d）后在东乡野生稻和OOP中都出现下调表达且同时落在QTL qCTS11.2位点所在区段的差异表达基因LOC_Os11g35390-DX作为东乡野生稻qCTS11.2位点中的1个候选基因，由于水稻耐冷相关基因往往是冷诱导表达基因，这种将水稻耐冷基因QTL定位与冷胁迫处理前后转录组分析获得的差异表达基因结合的基因克隆研究思路在很大程度上为耐冷QTL所在染色体区段候选基因的筛选提供了便利，有助于加快水稻耐冷基因的挖掘进程。

SMART在线分析软件预测结果表明，东乡野生稻LOC_Os11g35390-DX基因属于典型的R2R3型MYB转录因子基因，MYB转录因子是植物中一类重要的转录因子，因其结构中存在高度保守的DNA结合区域（myb结构域）而得名。MYB转录因子家族具有广谱作用，广泛参与植物组织的形态建成、次生代谢、激素调控及信号转导过程[22]。此外，在植物遭受非生物逆境胁迫时，MYB转录因子也通过调控下游基因的表达而参与生物应答。Liao等[23]将大豆GmMYB177基因转入拟南芥，提高了拟南芥的耐旱性;Zhai等[24]报道，MYBC1转录因子可独立于CBF通路负调控拟南芥的耐寒性。LOC_Os11g35390-DX基因编码的氨基酸序列与其他已克隆的水稻R2R3型MYB转录因子氨基酸序列的比对结果表明，它们之间的氨基酸序列同源性较低，表明水稻R2R3型MYB转录因子之间差异较大，推测存在多个进化分支。通过构建分子进化树发现，LOC_Os11g35390-DX基因与水稻R2R3型MYB基因Osmyb4、OsMYB30的亲缘关系最近。有研究发现，过表达水稻Osmyb4基因显著增强了拟南芥植株的抗寒性，同时，转基因植株中部分参与低温胁迫响应的基因表达量也发生了变化，表明水稻Osmyb4基因在植物响应低温胁迫的信号传导通路中起着开关作用[17]，而过表达OsMYB30基因的转基因水稻植株却呈现低温胁迫敏感的表型[18]。以上结果表明，与LOC_Os11g35390-DX基因亲缘关系较近的R2R3型MYB转录因子基因Osmyb4、OsMYB30在水稻应答低温胁迫的正负调控中发挥了重要的调节作用。结合LOC_Os11g35390-DX基因受低温诱导后表达量降低这一特性，推测LOC_Os11g35390-DX基因可能参与东乡野生稻低温胁迫应答的负调控过程。

通过在线分析软件PlantCARE分析东乡野生稻转录因子基因LOC_Os11g35390-DX的上游启动子序列，结果显示，在LOC_Os11g35390-DX基因的启动子序列中，除了包含一些常见功能顺式作用元件外，还存在MYB、MYC等两类被广泛报道参与植物非生物胁迫响应的基因表达调控网络的转录因子结合位点。由此推测，在东乡野生稻中，LOC_Os11g35390-DX基因作为1种MYB转录因子基因调节下游基因表达的同时，自身的表达也可能被上游MYB或MYC转录因子调控，推测其在东乡野生稻低温胁迫响应的基因表达调控网络中起到中间信号传递的作用。另外，预测分析结果表明，在LOC_Os11g35390-DX基因启动子上还分布着与脱落酸、茉莉酸及生长素等在植物响应逆境胁迫时发挥重要作用的植物激素信号通路相关联的顺式作用元件，表明该基因可能也参与了植物激素响应逆境胁迫的信号转导途径的基因表达调控。

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（责任编辑：徐艳）