猪链球菌3型分离菌的生物学特性及致病性

肖琦 赵霞玲 钱雯娴 郭佳慧 檀济敏 俞正玉 汪伟 孙珂 倪艳秀 祝昊丹 周俊明 姚火春 范红结 牛家强 索朗斯珠 何孔旺

摘要：为研究猪链球菌3型（Ss3）分离菌的生物学特性及致病性，对疑似Ss进行培养、染色、生化试验、猪链球菌PCR鉴定、血清分型PCR鉴定、多位点序列分型（MLST型）PCR鉴定，并对小鼠和仔猪进行致病性试验。结果显示，3株分离菌（分别命名为JSHZ菌株、GD7菌株、H30菌株）均呈革兰氏阳性，Ss PCR鉴定显示为阳性，血清分型PCR结果表明分离到的菌株为Ss3，序列型（ST）分别属于ST27型（JSHZ菌株）、ST1004型（GD7菌株）和ST 117型（H30菌株）;3株分离菌的生化特性与猪链球菌相符;3株分离菌经腹腔注射均可致死Balb/C小鼠，半致死量（LD50）分别为2.0×107CFU/ml、3.5×107CFU/ml和2.5×108CFU/ml。选择3株分离菌中毒力较强的JSHZ菌株进行仔猪致病性试验，感染仔猪会出现明显的关节红肿、跛行，体温多数升高至40.5～41.8 ℃，精神萎靡，食欲减少等症状;高剂量（每头仔猪注射JSHZ菌数6.0×109 CFU）处理可致仔豬出现食欲废绝、神经症状，甚至濒死，并在其脑组织中分离到Ss3。本研究结果为进一步开展Ss3的防控研究奠定了基础。

关键词：猪链球菌3型;生物学特性;致病性

中图分类号：S855.1+1文献标识码：A文章编号：1000-4440（2020）06-1475-07

Abstract：In order to study the biological characteristics and pathogenicity of Streptococcus suis serotype 3（Ss3） isolates， three strains of suspected Streptococcus suis （Ss）， strain JSHZ and GD7 isolated from acute dead piglets， strain H30 isolated from healthy piglet， were cultured， stained and identified by Ss PCR， Ss serotyping PCR， multilocus sequence typing （MLST） PCR， biochemical tests， and pathogenicity tests were conducted on mice and piglets. The results showed that all the three isolates were Gram-positive and Ss3. The sequence type （ST） of JSHZ， GD7 and H30 belonged to ST27， ST1004 and ST117， respectively. The biochemical characteristics of the three strains were consistent with Ss. The three strains could be lethal to mice by intraperitoneal injection， and the median lethal dose （LD50） were 2.0×107CFU/ml（JSHZ）， 3.5×107CFU/ml（GD7） and 2.5×108CFU/ml（H30）， respectively. The JSHZ with highest virulence to mice was selected for the pathogenicity test on piglets. The results showed that for piglets， JSHZ could cause obvious arthritis and limping， raise the body temperature to 40.5-41.8 ℃， reduce the spirit and appetite. High dose of JSHZ（6.0×109 CFU） could cause piglet anorexia， neurological symptoms and even being dying， and Ss3 was isolated from the brain tissues of dying piglet. This study can lay a foundation for further research on prevention and control of Ss3.

Key words：Streptococcus suis serotype 3;biological characteristics;pathogenicity

猪链球菌（Streptococcus suis）可引起仔猪急性死亡、败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎等，也可能感染人，甚至导致人死亡，是一种重要的人畜共患病病原菌[1]。猪链球菌根据荚膜可分成33个血清型（1～31型、33型和1/2型），其中血清2型在病猪和患病人群中的分离率最高[2-3]，血清3、7、9型在许多国家均较为普遍[4-5]。流行病学资料显示，猪链球菌2型、3型是加拿大和美国最主要的流行血清型[1]。在中国，Wei等[6]对2003-2007年全国16个省（市）分离的407株猪链球菌进行研究，发现2型为主要的血清型，占43.2%;其次是3型，占14.7%。王巍[7]从四川省20个县（区）不同日龄的发病猪中分离到34株猪链球菌，其中猪链球菌2型最多，占47.1%;其次是猪链球菌7型，占26.5%;猪链球菌3型排名第3，占11.8%。董志民等[8]对2009-2016年中国部分地区病料中分离的41株猪链球菌进行血清分型鉴定，血清2型或1/2型共10株（24.4%），9型7株（17.1%），3型6株（14.6%）。上述研究结果表明，猪链球菌3型（Ss3）在中国部分猪群中占据着非常重要的地位，但有关Ss3培养特性、生化特性、基因特征及致病性的详细报告较少。

1.10.2.2试验二选取5头30日龄健康仔猪，喂7 d无抗饲料，随机分成2组，一组3头，一组2头。选取方法1.10.1小鼠致病性试验中毒力较强的1株菌株，2组试验组仔猪分别注射菌液原液（原液组2）和10倍浓缩液，每头仔猪耳缘静脉注射2 ml。仔猪感染后的观察、测温、细菌分离鉴定、剖检、组织学观察均与方法1.10.2.1一致。

2结果与分析

2.1细菌分离培养染色鉴定

采集的病料样品在THB固体培养基上划线，然后在THB液体培养基中增菌，纯培养后获得单一纯菌落，观察菌落形态，并进行革兰氏染色镜检。结果发现，从急性死亡猪肺脏中分离到的2株菌株（分别命名为JSHZ菌株和GD7菌株）为疑似猪链球菌，从健康猪扁桃体中分离到的1株菌株（命名为H30菌株）也为疑似猪链球菌，各分离菌在THB固体培养基上均长成灰白色菌落，菌落直径为1～2 mm。分离菌涂片经革兰氏染色后，在光学显微镜油镜下观察，为蓝紫色的短链状球菌。

2.2猪链球菌PCR鉴定

利用Ss gdh扩增引物对获得的3株猪链球菌疑似菌株进行PCR鉴定和序列比对，结果（图1）显示，3株分离菌均能扩增出689 bp左右大小的片段，与预期结果相符。扩增片段序列与Ss HB30菌株gdh基因（序列号FJ572237.1）100%同源，说明分离到的3株菌株均为Ss。

2.3猪链球菌血清型PCR鉴定

对3株分离菌进行Ss血清型PCR鉴定和序列比对，结果（图2）显示，仅Ss3引物PCR能扩增出大小约为340 bp的目的片段，其他各血清型引物PCR扩增结果均为阴性。Ss3引物PCR扩增的片段序列与Ss3 cps3L基因（序列号KC537365.1）100%同源，表明分离到的3株菌株均为Ss3。

2.4MLST型PCR鉴定

MLST型PCR鉴定结果（表1）显示，3株分离菌分属3个不同的ST型，JSHZ菌株属于ST27型，GD7菌株属于ST1004型，H30菌株属于ST117型。

2.5生化试验

在马尿酸钠、6.5%NaCl高盐肉汤、甘露醇、山梨醇、木糖、阿拉伯糖、七叶苷、尿素试验中，3株分离菌的结果为阴性;在乳糖、血清菊糖、水杨素、棉子糖、蕈糖、蔗糖、葡萄糖试验中，3株分离菌的结果为阳性。表明3株Ss3分离菌均符合Ss的生化特性。

2.6分离菌株生长曲线

图3显示，JSHZ菌株的对数生长期为培养后0～5 h，GD7菌株的对数生长期为培养后0～3 h，H30菌株的生长速度较为缓慢，对数生长期不明显。在生长平台期，JSHZ菌株和GD7菌株的活菌数分别达到2.50×108CFU/ml和2.85×108CFU/ml，而H30菌株的活菌数仅为2.25×107CFU/ml。说明从急性死亡猪肺脏中分离到的2株Ss3菌株（JSHZ菌株、GD7菌株）生长比较快，生长平台期的菌数较多;而从健康猪扁桃体中分离到的Ss3菌株（H30菌株）生长比较慢，生长平台期的菌数较少。

2.7致病性

2.7.1对小鼠的致病性表2显示，用不同稀释倍数的JSHZ、GD7、H30菌液對Balb/C小鼠进行腹腔注射，注射后4 h，各组均有部分小鼠开始出现被毛粗乱、精神萎靡等症状，随后多数表现出拉稀、闭眼，有的出现神经症状。Balb/C小鼠死亡主要发生在14～48 h。死亡小鼠的血液及肝、脾、肺、脑中均能分离到大量菌落形态单一的Ss，血清分型PCR鉴定结果均为Ss3。JSHZ、GD7、H30菌株对4周龄Balb/C小鼠的半致死量（LD50）分别为2.0×107CFU/ml、3.5×107CFU/ml和2.5×108CFU/ml，说明JSHZ菌株对Balb/C小鼠的致病性最强，而H30菌株对Balb/C小鼠的致病性相对较弱。

2.7.2对仔猪的致病性

2.7.2.1试验一结果（表3）显示，仔猪在感染JSHZ菌液后18～42 h出现关节红肿、跛行、体温升高、精神萎靡、食欲减少等临床症状。在感染后的第1 d仔猪体温升高，多数为40.5～41.0 ℃，最高可达41.3 ℃，但在感染后的第2～3 d体温全部恢复正常。关节红肿和跛行等症状也在感染后第3～4 d消失，所有仔猪在观察期内均未死亡。感染仔猪的血液分菌结果显示，原液组1和1∶10稀释组仔猪在感染后1～2 d均能分离出Ss3;而1∶100稀释组仔猪在各个时间点均未能分离出Ss3。在感染后的第4 d，仍能从有关节红肿症状的仔猪关节液中分离出Ss3;感染后第7 d对仔猪进行剖检，所有仔猪的血液及肝、脾、肺、脑中均未分离出Ss3。

2.7.2.2试验二结果（表3）显示，本试验中2组仔猪感染后的临床表现与试验一中的原液组1和1∶10稀释组基本一致，体温升高、关节红肿、跛行等症状也多在感染后第2～4 d消失。10倍浓缩组有一头仔猪体温升高至41.8 ℃，较高体温持续至第5 d，并在攻毒后第2 d开始食欲废绝，卧地不起，浑身发抖，四肢呈划水状，至第5 d时处于濒死状态。感染仔猪的血液分菌结果显示，2组仔猪在注射JSHZ菌液后第1～3 d能分离出Ss3。在感染后第5 d，仍能从有关节红肿症状的濒死仔猪关节液中分离出Ss3;在感染后第5 d扑杀濒死仔猪，从其脑组织中能分离到Ss3，从肝、脾、肺中未分离到Ss3;在感染后第7 d剖检其他仔猪，其血液及肝、脾、肺、脑中均未分离到Ss3。表明JSHZ菌液高剂量（10倍浓缩）处理会导致仔猪出现典型的神经症状，并可能引起猪死亡。

图4显示，10倍浓缩组的濒死仔猪可见心包积液，脑部出血，其他脏器病变不明显;对攻毒后第7 d扑杀的其他感染仔猪进行剖检时发现心包积液，其他脏器未见明显病变。组织病理切片显微观察结果（图5、图6）显示，10倍浓缩组的濒死仔猪脑组织中形成明显血管套，大脑皮层局部胶质细胞增生;其他感染组仔猪部分可见心脏有局灶性心肌纤维变性坏死，大脑皮层早期局灶性轻微梗死，小角质细胞增多，肝、脾、肺组织未见明显病理变化。

3讨论

在猪链球菌33个血清型中，猪链球菌2型（Ss2）最为流行，而且Ss2还是一种重要的人兽共患病原菌。1998-1999年和2005年分别在中国江苏省南通市和四川省资阳市、内江市等地发生人感染Ss2的疫情[13]。除Ss2外，常见的能引起猪或人感染的猪链球菌还有Ss3、Ss9和Ss7[4]，Ss3是北美洲主要的流行血清型，特别是在美国，Ss3的分离率甚至高于Ss2[14-15]。流行病学资料显示，在中国Ss3也是优势血清型之一[6-8]。因此，系统开展Ss3分离菌的生物学特性和致病特性研究对指导猪链球菌病的防控非常必要。

本研究从急性死亡猪肺脏中分离到JSHZ菌株和GD7菌株，从健康猪扁桃体中分离到H30菌株，经鉴定均为Ss3，3株菌株的菌落特征、菌体形态及生化特性基本一致，但3株菌株的ST序列分型却不同，分别属于ST27型、ST1004型和ST117型。ST27型为Ss3菌株常见的ST型[1]，有学者曾分离到ST117型的Ss3菌株[10]，也有学者曾分离到属于ST117型的Ss2菌株[10]，而ST1004型为本研究最新鉴定和上传的ST型，说明Ss3的ST型呈现多样性。在生长特性方面，JSHZ菌株和GD7菌株生长较快，JSHZ菌株的对数生长期为培养后0～5 h，GD7菌株的对数生长期为培养后0～3 h;而H30菌株生长缓慢，没有明显的对数生长期，在生长平台期的活菌数仅能达到JSHZ菌株和GD7菌株的9.00%和7.89%，这种生长能力的差异是否与菌株的致病特性相关还有待进一步研究。小鼠致病性试验结果显示，虽然H30菌株对小鼠的致病性低于JSHZ菌株和GD7菌株，但仍表现出较强的致病性，说明健康猪也可能携带有致病性的Ss3菌株，并成为潜在的传染源。JSHZ菌株、GD7菌株和H30菌株均能引起部分小鼠出现神经症状，并能在其脑组织中分离到接种的相应菌株，表明Ss3可突破小鼠血脑屏障进入脑组织。

用JSHZ菌液注射仔猪，可导致仔猪出现体温升高、关节红肿、跛行、精神萎靡、食欲减少等典型的Ss临床症状。在感染早期，较高剂量组（每头仔猪注射菌数不低于5×107 CFU）仔猪的血液中均能分離到接种的Ss3菌株，表明JSHZ菌株人工感染猪成功。在感染JSHZ菌株后，多数仔猪的临床症状仅持续2～3 d，但高剂量（每头猪注射菌数为6×109 CFU）注射时有一头仔猪出现了猪链球菌急性病例中典型的神经症状，组织病理学检查发现明显出现血管套，大脑皮层局部胶质细胞增生，同时在其脑内分离到Ss3，表明Ss3 JSHZ菌株亦能突破猪血脑屏障。Ss3 能人工感染猪，并能引起猪链球菌感染的典型症状和病理变化。

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（責任编辑：王妮）