响应面法优化香水莲花甾醇的超声提取工艺

付调坤 周伟 廖良坤 付琼 李积华

摘  要：为了分析香水莲花的植物甾醇含量并优化其超声提取工艺，采用高效液相色谱（HPLC）法测定香水莲花中菜籽甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇的含量，再以上述3种甾醇提取量为评价指标，对液料比、超声提取温度和超声提取时间进行单因素试验，在此基础上，再采用Box-Behnken响应面法优化香水莲花甾醇提取工艺并进行验证。结果表明，影响香水莲花甾醇提取量的主次因素是液料比>提取时间>提取温度，其最优工艺条件为以95%乙醇为提取溶剂、超声功率100 W、液料比30∶1（mL/g）、超声提取温度60 ℃、超声提取时间30 min;在最优工艺条件下进行验证实验，得出香水莲花中甾醇含量为菜籽甾醇64.61 mg/100 g、菜油甾醇40.77 mg/100 g、β-谷甾醇99.04 mg/100 g，总甾醇204.42 mg/100 g，综合评分与预测值相比差异不显著（P<0.05）。研究结果为香水莲花资源的开发和利用提供参考。

关键词：香水莲花;植物甾醇;超声提取工艺;Box-Benhnken响应面法

中图分类号：S59      文献标识码：A

Abstract： To analyze the phytosterol content in Nymphaea hybrid and optimize its ultrasonic extraction technology， high performance liquid chromatography （HPLC） method was adopted for content determination of brassicasterol， campesterol and β-sitosterol in N. hybrid， and the contents of above 3 components were taken as index to carry out single factor test on liquid-solid ratio， ultrasonic extraction temperature and ultrasonic extraction time. Based on that， Box-Behnken response surface method was used to optimize the extraction process parameter of N. hybrid sterols and the results were tested and verified. The results showed that the factors affecting the sterol amount extracted from N. hybrid were liquid- solid ratio > ultrasonic extraction time > ultrasonic extraction temperature. The optimal process is as follows： 95% ethanol is used as extraction solvent， ultrasonic power is 100 W， liquid-solid ratio is 30∶1 （mL/g）， ultrasonic extraction temperature is 60 ℃， ultrasonic extraction time is 30 min. According to the optimal process conditions， the results showed that the sterol content of N. hybrid was as followed： the content of brassicasterol was 64.61 mg/100 g， the content of campesterol was 40.77 mg/100 g， the content of β-sitosterol was 99.04 mg/100 g， the total sterol content was 204.42 mg/100 g. The comprehensive score was not significantly different from the predictive value （P<0.05）. The results provide reference for the development and utilization of N. hybrid.

Keywords： Nymphaea hybrid; phytosterol; ultrasonic extraction technology; Box-Behnken response surface method

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.024

香水蓮花（Nymphaea hybrid）是睡莲科（Nymphaeaceae）睡莲属（Nymphaea）的一种多年水生宿根草本植物，香气宜人，颜色鲜艳，观赏价值高。20世纪70年代香水莲花被引入我国热带亚热带地区，因其有金、黄、紫、蓝、赤、茶、绿、红和白共9种不同色系，故将其称为九品香水莲花[1]。香水莲花不仅是一种观赏植物，还具有多种药效和保健作用[2-3]，是一种新兴的药食两用植物，具有很高的经济价值。香水莲花中含有丰富的植物性胎盘素[4-5]，还含有蛋白质、多糖、多酚、黄酮、植物甾醇、生物碱等成分[6]。其中，植物甾醇具有促进胆固醇的降解代谢[7]、调节免疫[8]、抑制肿瘤[9]、抑制乳腺增生[10]、抗炎抗菌[11]等作用，在医药、食品、化妆品等领域都有重要应用，具有极大的药用价值和开发价值[12]。但目前有关香水莲花中的植物甾醇组分、含量及提取的研究报道极少。

根据本课题组的前期研究得知，香水莲花中含有多种植物甾醇，如麦角甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、蒲公英甾醇、β-谷甾醇等。本文以香水莲花为研究对象，采用超声辅助法提取香水莲花中的甾醇，并采用Box-Benhnken响应面法优化提取工艺，旨在为香水莲花的资源开发和高值化利用提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  材料与试剂  香水莲花由海南大地农旅文化投资有限公司提供;95%乙醇（分析纯）、无水甲醇（分析纯）、甲醇（色谱纯），上海麦克林生化科技有限公司;麦角甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、蒲公英甾醇、β-谷甾醇标准品，北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2  仪器与设备  ALPHA2-4真空冷冻干燥机，德国Christ公司;SK2210LHC超声波反应器，上海科导公司;N-EVAP-24氮吹仪，美国Organomation公司;LC-20A高效液相色谱仪，日本岛津公司。

1.2  方法

1.2.1  原料的预处理  将新鲜的香水莲花花瓣洗净后置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥48 h，然后将冻干好的香水莲花花瓣用粉碎机粉碎过60目筛，即得到香水莲花冻干粉末，密封冷藏备用。

1.2.2  香水莲花甾醇的提取  准确称取一定量的香水莲花冻干粉末，按一定液料比（mL/g）加入95%乙醇，置于超声波反应器中超声辅助提取，提取液于10000 r/min高速离心20 min，取上清液置于氮吹仪中吹干，即得到香水莲花甾醇提取物。

1.2.3  HPLC法检测香水莲花甾醇含量  （1）色谱检测条件。色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流动相为甲醇，流速0.7 mL/min，柱温35 ℃，紫外检测器，检测波长210 nm，进样量20 μL。

（2）绘制标准曲线。通过预实验，在香水莲花中检测到麦角甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、蒲公英甾醇、β-谷甾醇。分别准确称取上述5种甾醇的标准品各25 mg，用无水甲醇配制成1.0 mg/mL的标准溶液，再稀释为不同浓度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的标准溶液。按照色谱检测条件进样检测，每个浓度标准品溶液重复检测3次。分别以溶液浓度和峰面积作为横、纵坐标，绘制标准曲线。

（3）混合标准品的配制及色谱检测。分别精密称取5种甾醇标准品各1 mg，用无水甲醇溶解并混合，定容至2 mL，按色谱检测条件进样检测，得到混合标准品的色谱图。

（4）样品检测。提取的香水莲花甾醇提取物用无水甲醇溶解，定容至3 mL，准确移取1.5 mL样品至样品瓶中，按照色谱条件进样检测，每个样品重复进样3次。

1.2.4  单因素实验  以95%乙醇为提取溶剂，在超声功率为100 W的条件下，依次分别考察液料比（mL/g）（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1）、超声提取温度（35、40、45、50、55、60 ℃）、超声提取时间（30、60、90、120、150、180 min）对香水莲花中甾醇提取量的影响。

1.2.5  响应面实验  根据Box-Behnken试验设计原理，在1.2.4实验结果的基础上，以提取的菜籽甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇含量的综合评分为响应值，设计3因素3水平实验，对提取工艺参数进行优化，实验因素与水平见表1。

1.3  数据处理

采用Design Expert 8.0软件对数据进行统计分析，并采用Origin 8.6软件作图。

2  结果与分析

2.1  香水莲花的甾醇含量分析

2.1.1  5种甾醇的标准曲线  根据不同浓度甾醇标准溶液的色谱图，计算色谱峰面积并绘制标准曲线。结果显示，麦角甾醇标准曲线的回归方程为y=11417858.5x?233800.3，相关系数R2=0.9996;菜籽甾醇标准曲线的回归方程为y=7931156.5x? 135202.7，相关系数R2=0.9946;菜油甾醇标准曲线的回归方程为y=6936456.5x?310802.5，相关系数R2=0.9935;蒲公英甾醇标准曲线的回归方程为y= 14169061.5x?165694.7，相关系数R2=0.9906;β-谷甾醇标准曲线的回归方程为y=5074077.0x? 50681.6，相关系数R2=0.9992。所得回归方程的线性关系均良好。

2.1.2  香水莲花甾醇的定性与定量分析  图1和图2分别为5种甾醇混合标准品和香水莲花甾醇提取液（液料比30∶1 mL/g、超声提取温度60 ℃、超声提取时间30 min）的HPLC色谱图。将图2与图1对比，根据色谱峰的保留时间，对香水莲花提取液中的甾醇成分进行定性分析，确定保留时间为14.39、16.17、18.51、19.94、20.78 min 的色谱峰分别为麦角甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇、蒲公英甾醇、β-谷甾醇的吸收峰。样品中可能含有其他物质，因此保留时间与混合标准品色谱图中的对应成分略有不同。

根据2.1.1建立的甾醇标准曲线对图2进行定量分析，计算得到香水莲花甾醇提取液中5種甾醇的含量，结果见图3。由图3可知，香水莲花中含量较高的甾醇为菜籽甾醇、菜油甾醇和β-谷甾醇（均超过0.4 mg/g），因此选择这3种甾醇提取量作为提取工艺优化的考察指标。

2.2  单因素实验结果

本文采用高效液相色谱法测得香水莲花中含量较高的为菜籽甾醇、菜油甾醇、β-谷甾醇，以这3种甾醇提取量为评价指标，对液料比、超声提取温度和超声提取时间进行单因素实验;在此基础上，采用Box-Behnken响应面法优化香水莲花甾醇提取工艺并进行验证。结果表明，影响香水莲花甾醇提取量的主次因素是液料比>提取时间>提取温度，其最优工艺条件为以95%乙醇为提取溶剂、超声功率100 W、液料比30∶1（mL/g）、超声提取温度60 ℃、超声提取时间30 min，预测综合评分为2.7584;在最优工艺条件下进行验证实验，香水莲花中甾醇含量为：菜籽甾醇64.61 mg/100 g、菜油甾醇40.77 mg/100 g、β-谷甾醇99.04 mg/100 g，总甾醇204.42 mg/100 g，综合评分为2.7423，与预测值相比差异不显著。

参考文献

周  琦，曾  莹，祝遵凌， 等. 响应面法优化香水莲花多酚的提取工艺及其抗氧化活性[J]. 现代食品科技， 2018， 34（11）： 200-207.

车  璐， 吴晓琴， 郑茜茜， 等. 香水莲花抑制大鼠前列腺增生的试验研究[J]. 中国食品学报， 2015（2）： 28-33.

张  丹， 姚正颖， 侯北伟， 等. 香水莲花提取物对胰脂肪酶活性的抑制作用[J]. 食品科技， 2017， 42（3）： 227-231.

刘家文， 陈  燕， 李  晖， 等. 香水睡莲花茶制作工艺探索[J]. 农业研究与应用， 2014（5）： 30-31.

Park G， Sim Y， Lee W， et al. Protection on skin aging mediated by antiapoptosis effects of the water Lily （Nymphaea tetragona Georgi） via reactive oxygen species scavenging in human epidermal keratinocytes[J]. Pharmacology， 2016， 97（5-6）： 282-293.

赵  军， 徐  芳， 吉腾飞， 等. 睡莲属植物化学成分及生物活性研究进展[J]. 天然产物研究与开发， 2014， 26（1）： 142-147.

Hicks k B， Moreau R A. Phytosterols and phytostanols： Functional food cholesterol busters[J]. Food Technology， 2001， 55（1）： 63-67.

Egbert H， Isabelle D， Jogchum P， et al. Biological effects of oxidized phytosterols： A review of the current knowledge[J]. Progress in Lipid Research， 2008， 47（1）： 37-49.

Awad A B， Chinnama M， Fink C S， et al. β-Sitosterol activates Fas signaling in human breast cancer cells[J]. Phytomedicine， 2007， 14（11）： 747-754.

Awad A B， Downie A， Fink C S， et al. Dietary phytosterol inhibits the growth and metastasis of MDA-MB-231 human breast cancer cells grown in SCID mice[J]. Anticancer Research， 2000， 20（2）： 821-824.

Gemma B， Miguel A C， Magda R， et al. Phytosterols： physiologic and metabolic aspects related to cholesterol- lowering properties[J]. Nutrition Research， 2008， 28（4）： 217-225.

付調坤， 周  伟， 夏  文， 等. 火龙果茎中3种主要甾醇的提取工艺研究[J]. 热带农业科学， 2019， 39（12）： 42-50.

张娟聪. 植物甾醇的改性研究[D]. 杭州： 浙江工业大学， 2009.

马素换. 芝麻植物甾醇提取与氧化特性的研究[D]. 郑州： 河南工业大学， 2015.

车  璐. 香水莲花抗氧化及抑制5α-还原酶的研究[D]. 杭州： 浙江大学， 2013.

姜洪芳， 金敬宏， 赵伯涛， 等. 香水莲花总提取物对小鼠急性酒精肝损伤的实验研究[J]. 中国野生植物资源， 2012， 31（5）： 18-19， 26.

孙玉洁. 香水莲花美白保湿作用研究[D]. 杭州： 浙江大学， 2016.