香露兜不同叶位挥发性成分差异性分析

郭培培 黄志 秦晓威 陈思平 鱼欢 宗迎 贺书珍

摘  要：以香露兜（Pandanus amaryllifolius Roxb.）不同葉位叶片组织为材料，采用气相色谱–质谱联用（GC-MS）技术对其挥发性成分进行鉴定，揭示不同叶位挥发性成分组成变化规律。结果表明：香露兜8个不同叶位叶片挥发性成分由呋喃酮类、吡咯类、呋喃类等10类21种物质组成，3-甲基-2（5H）-呋喃酮、新植二烯、2-乙酰-1-吡咯啉、叶绿醇、2，3-二氢苯并呋喃、2，4-二叔丁基酚、羟基丙酮、棕榈酸乙酯和亚油酸乙酯9种共有物质的含量均存在极显著差异（P0.001）。其中，特征挥发性物质2-乙酰-1-吡咯啉平均含量为（94.0036.66）μg/g，倒5叶位含量最高（122.99±3.48）μg/g，倒1至倒8叶位整体呈先升高后降低的变化趋势。主成分分析结果表明，倒1叶位主要挥发性成分为3-甲基-2（5H）-呋喃酮、棕榈酸乙酯和甲酸庚酯，倒2、3和4叶位主要挥发性成分为叶绿醇、2-丁基-1-辛醇、3-甲基-2（5H）-呋喃酮、2-乙酰-1-吡咯啉、2，3-二氢苯并呋喃、新植二烯、角鲨烯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯和2，4-二叔丁基酚，倒5叶位主要挥发性成分为2-乙酰-1-吡咯啉、2，3-二氢苯并呋喃和角鲨烯;倒6、7、8叶位主要挥发性成分为角鲨烯、新植二烯、2-乙酰-1-吡咯啉和羟基丙酮。香露兜不同叶位挥发性物质组成及含量存在一定差异，将为其标准化采收提供理论依据。

关键词：香露兜;叶位;挥发性成分;2-乙酰-1-吡咯啉

中图分类号：R284.1      文献标识码：A

Abstract： The difference of volatile components in different leaf position of Pandanus amaryllifolius Roxb. was identified by the gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） method in order to understand the changes of volatile components in different leaf positions. The results showed that 21 components were detected in eight different leaf positions， which belonged to 10 chemical groups， such as furanones， pyrroles， furans， etc. The eight different leaf positions shared nine volatile components， and showed significant difference in the contents， such as 3-methyl-2（5H）- furanone， neophytadiene， 2-acetyl-1-pyrroline， phytol， coumaran， 2，4-di-tert-butylphenol， acetol， ethyl palmitate and ethyl linoleate （P<0.001）. The content of the main component 2-acetyl-1-pyrroline was （94.00±36.66）μg/g， which increased at first and then decreased from the 1st to 8th leaf position， and the highest content at the 5th leaf position （122.99±3.48）μg/g. Principal component analysis showed that the 1st leaf position was characterized by high contents of 3-methyl-2（5H）-furanone， ethyl palmitate and heptyl methanote. The 2nd， 3rd and 4th leaf position exhibited high content of phytol， 2-butyloctanol， 3-methyl-2（5H）-furanone， 2-acetyl-1-pyrroline， coumaran， neophytadiene， squalene， ethyl palmitate， ethyl linoleate， and 2，4-di-tert-butylphenol. The 5th leaf position has exhibited high contents of 2-acetyl-1-pyrroline， coumaran and squalene. The 6th， 7th and 8th leaf position were mainly composed of squalene， neophytadiene， 2-acetyl-1-pyrroline and acetol. The difference of the composition and content of volatiles in different leaf position of Pandanus amaryllifolius Roxb.， which would provide a basis for harvesting quality.

Keywords： Pandanus amaryllifolius Roxb.; leaf positions; volatile components; 2-acetyl-1-pyrroline

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.12.021

香露兜（Pandanus amaryllifolius Roxb.），又名斑兰叶、香兰叶，为露兜树科（Pandanaceae）露兜树属（Pandanus）热带园艺作物[1]。其叶片的主要特征挥发性物质为2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrroline），能散发出一种特殊香气——粽香[2]。同时，香露兜中富含角鲨烯（squalene）和叶绿醇（phytol）等活性成分，具有增强细胞活力、加快新陈代谢、提高人体免疫力的作用，广泛应用于食品和医药行业，市场潜力巨大[3-5]。香露兜主栽于斯里兰卡、印度、新加坡、印度尼西亚、泰国、马来西亚等南亚及东南亚国家，年产鲜叶约400 万t，其中东南亚占80%以上。我国香露兜为境外引进作物，20世纪50年代由印度尼西亚引进并试种成功[1]，主栽于海南、云南等地，已逐步发展成为热带特色农业产业，开发利用前景广阔。

植物挥发性物质作为一种“化学语言”，其合成与释放决定着食用器官部位的风味品质特性。香露兜叶为单叶、顶生，排列成螺旋状，是主要的食用器官[1]。相关研究表明，香露兜挥发性物质主要由呋喃类、吡咯类、醇类、烯烃类、酯类等化合物组成[5-7]。Jiang等[7]采用二氯甲烷溶剂提取法和气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）鉴定出2-乙酰-1-吡咯啉、3-己醇（3-hexanol）、4-甲基-1-戊醇（4-methyl-1-pentanol）和3-甲基- 2-（5H）-呋喃酮[3-methyl-2-（5H）-furanone]等化合物是新加坡香露兜叶片中的关键挥发性物质。其中，2-乙酰-1-吡咯啉的分子量为111.14，極易挥发，具有粽香风味[8]，被列入中华人民共和国国家标准GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》。Wakte等[9]利用顶空固相微萃取-气相色谱火焰离子化检测器联用（HS-SPME/GC-FID）技术鉴定出印度半岛不同生态区域香露兜叶片挥发性成分19种，不同生态产区的2-乙酰-1-吡咯啉含量变异区间为6.25～ 12.25 mg/kg。此外，任竹君等[4]利用水蒸气蒸馏法和GC-MS技术鉴定了海南香露兜叶片挥发性成分，发现香露兜含有角鲨烯、叶绿醇等活性成分，在食品加工和制药等领域有重要的开发价值。近年来，尹桂豪等[3]、陈小凯等[10]利用超临界CO2萃取法研究香露兜叶挥发性成分，结果也表明香露兜含角鲨烯、叶绿醇等挥发性物质，但未鉴定出2-乙酰-1-吡咯啉。

目前，国内外大部分研究局限于笼统地分析香露兜挥发性物质组成，而关于香露兜不同叶位器官的挥发性成分组成变化规律尚不清楚，最佳采收叶片部位不确定。为了解香露兜不同叶位挥发性成分组成变化规律，本研究以香露兜不同叶位鲜叶为材料，采用超声辅助无水乙醇溶剂提取和GC-MS技术分析香露兜鲜叶中的挥发性成分，以期确定香露兜的最佳采收叶位，为香露兜标准化采收提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  材料  试验材料香露兜（Pandanus amaryllifolius Roxb.）采自海南兴隆热带植物园，种植面积600 m2，栽培措施中未使用植物生长调节剂。依据香露兜植物学形态特征[1]，将植株叶片自顶端至基部按叶位顺序进行排列，依次标记为倒1叶位（L1）、倒2叶位（L2）、倒3叶位（L3）、倒4叶位（L4）、倒5叶位（L5）、倒6叶位（L6）、倒7叶位（L7）和倒8叶位（L8）。种植基地以“田”字型均等分为4个小区，每个小区采集5株，采集植株无病虫害和无机械损伤的叶位叶片，立即带回实验室处理。

1.1.2  试剂与仪器  无水乙醇（含量≥99.7%），西陇科学股份有限公司;2-乙酰-1-吡咯啉标准品（纯度95%），加拿大Toronto Research Chemicals公司;叶绿醇标准品（GC≥90%），上海源叶生物科技有限公司;角鲨烯标准品（GC≥98%），上海源叶生物科技有限公司;C7～C40正构烷烃混标标准品（纯度95%），上海安谱实验科技有限公司。Aglient-7890B/5977B气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司。

1.2  方法

1.2.1  挥发性物质的提取  香露兜不同叶位新鲜叶片，用蒸馏水清洗叶面杂质后，用白色纱布将水吸干静置5 min，环境温度为（22±3）℃，将其剪碎放置塑封袋。立即分别称取5.0 g剪碎的鲜叶样品于50 mL离心管，加入15 mL无水乙醇，在50 ℃、400 W、40 kHz条件下超声萃取60 min，经0.22 μm有机相针式滤器（尼龙）过滤，获得提取液，上机检测。

1.2.2  GC-MS分析条件  色谱条件：色谱柱为DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）弹性石英毛细管柱，载气为高纯氦气（99.999 %），载气流量1 mL/min，不分流进样，进样口温度250 ℃，接口温度250 ℃，柱初始温度50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升温至100 ℃，再以6 ℃/min 升温至250 ℃，保持5 min。

质谱条件：离子源为EI;电压70 eV;离子源温度230 ℃;四极杆温度150 ℃，进样口温度为250 ℃，扫描质量范围30～450 amu。

1.3  数据分析

1.3.1  定性分析  结合质谱和保留指数（RI）对香露兜挥发性成分进行定性，其中质谱分析结果在NIST 2017谱库进行检索，比对定性;使用C7～ C40正构烷烃混标，以相同条件进行GC-MS 分析，根据其保留时间，按照线性方程计算各挥发性成分的保留指数RI[11]，与文献对照进行定性分析。

1.3.2  定量分析  精密吸取2-乙酰-1-吡咯啉、叶绿醇、角鲨烯标准品，以及甲醇（色谱纯），按照50、100、150、300、500 μg/mL的溶液浓度梯度分别进行配制，按照样品的色谱条件，标准品梯度浓度由低到高的顺序依次进样，每个浓度进样3次，以各组分浓度为横坐标，3次测定峰面积的平均值为纵坐标，得到各组分的定量线性关系。利用峰面积按照线性方程计算2-乙酰-1-吡咯啉、叶绿醇、角鲨烯的含量，再根据2-乙酰-1-吡咯啉含量对其他挥发性物质进行半定量[12]，计算公式：

Xi = （ Ai /As） × Cs

其中：Xi为待测物质含量;Cs为样品中2-乙酰-1-吡咯啉含量;As为2-乙酰-1-吡咯啉的峰面积;Ai为待测物的峰面积。

1.3.3  数据处理  采用Bray-Curtis相似性检验，判断香露兜不同叶位挥发性成分组成间的相似性程度。采用ANOSIM非参数检验，进行不同叶位叶片挥发性成分组成的差异性分析。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行不同叶位共有化合物含量的差异分析。采用主成分分析（PCA）进行不同叶位叶片主要挥发性物质成分组成分析。数据统计采用Windows的R软件3.5.1版本进行分析。

2  结果与分析

2.1  香露兜不同叶位叶片挥发性成分种类分析

利用GC-MS技术对香露兜不同叶位叶片挥发性成分检测，结果表明8个不同叶位共检测出21种挥发性化合物，属于吡咯类、醇类、酚类、呋喃类、呋喃酮类、醛类、酸类、酮类、烯烃类和酯类共10类（表1）。由图1A可见，香露兜不同叶位叶片挥发性成分种类组成和数量均存在差异，L1至L8叶片由8～10類化合物组成，且L1至L8叶片挥发性成分丰富度为（13.75±1.28）种（n=8，值域为11～15种）。

不同叶位叶片挥发性成分含量差异较大（图1B）。其中，呋喃酮类挥发性成分相对含量高达（36.62±12.78）%（n=8，值域为24.36%～62.02%），且由L1至L8整体呈现递减的变化规律;其次为烯烃类化合物，占挥发性成分含量的（20.96± 8.09）%（n=8，值域为6.66%～33.69%），且L1～L8整体呈现递增的变化规律;吡咯类化合物，占挥发性成分含量的（13.65±5.07）%（n=8，值域为1.23%～15.91%），L5叶片中吡咯类的含量是L1叶片的19.01倍，且L1至L8整体呈现递增的变化规律。此外，呋喃类、酮类、酯类和醇类等化合物种类含量相对较高，分别为（11.19±2.47）%（n=8，值域6.03%～13.21%）、（8.15±2.08）%（n=8，值域为5.93%～11.89%）、（3.76±2.80）%（n=8，值域为1.72%～10.45%）和（3.70±2.21）%（n=8，值域为1.58%～8.14%）。然而，醛类、酚类和酸类等化合物种类含量均低于2%。

2.2  香露兜不同叶位叶片挥发性成分组成分析

Bray-Curtis分析表明，香露兜不同叶位挥发性成分组成的Bray-Curtis指数为79.92%，且不同叶位间存在极显著差异（ANOSIM，R=0.9993，P0.001），表明丰富的挥发性成分多样性组成存在于香露兜不同叶位间。差异性检验表明，3-甲基-2（5H）-呋喃酮、新植二烯、2-乙酰-1-吡咯啉、叶绿醇、2，3-二氢苯并呋喃、2，4-二叔丁基酚、羟基丙酮、棕榈酸乙酯和亚油酸乙酯这9种共有挥发性成分含量在不同叶位之间差异显著（图2）。

3-甲基-2（5H）-呋喃酮是香露兜“焦糖”风味的主要特征挥发性物质。由图2A可见，不同叶位间3-甲基-2（5H）-呋喃酮含量差异极显著（F7，16=512.62，P0.001），其平均含量为（241.18± 68.80）μg/g（值域为162.86～333.24 μg/g）。其中，L1叶位3-甲基-2（5H）-呋喃酮含量高达（327.38± 8.04）μg/g，是L8叶位3-甲基-2（5H）-呋喃酮含量[（162.86±1.44）μg/g]的2倍，且由L1至L8叶位呈递减变化规律。

由图2B可见，与3-甲基-2（5H）-呋喃酮变化规律相反，新植二烯含量由L1至L8叶位呈递增变化趋势，不同叶位间新植二烯含量差异极显著（F7，16=109.70，P0.001），其平均含量为（59.58±19.97）μg/g（值域为35.16～97.69 μg/g）。其中L8叶位新植二烯含量最高[（97.69±2.07）μg/g]，是L1叶位含量[（35.16±4.86）μg/g]的2.78倍。

由图2C可见，2-乙酰-1-吡咯啉是香露兜“粽香”风味的主要特征挥发性物质。不同叶位间2-乙酰-1-吡咯啉含量差异极显著（F7，16=1226.73，P0.001），其平均含量为（94.00±36.66）μg/g（值域为6.47～122.99 μg/g）。其中，L5叶位含量最高[（122.99±3.48）μg/g]，而L1叶位含量最低[（6.47± 0.70）μg/g]，且由L1至L8叶位呈现先升后降的变化规律。同时，叶绿醇、2，3-二氢苯并呋喃和2，4-二叔丁基酚挥发性物质含量由L1至L8叶位均呈先升后降的变化规律，其中L5叶位含量最高，分别为（46.91±0.38）μg/g、（107.22±1.25）μg/g和（12.11±0.45）μg/g。

由图2D可见，不同叶位间羟基丙酮、棕榈酸乙酯和亚油酸乙酯平均含量分别为（52.28± 14.91）μg/g（F7，16=320.27，P0.001）、（14.85± 9.25）μg/g（F7，16=158.67，P0.001）和（7.59± 1.54）μg/g（F7，16=61.53，P0.001），其中L7叶位羟基丙酮含量最高[（80.55±1.68）μg/g]，而L1叶位棕榈酸乙酯和亚油酸乙酯含量最高，分别为（35.74±2.61）μg/g和（9.25±0.17）μg/g，但不同叶位间羟基丙酮、棕榈酸乙酯和亚油酸乙酯含量整体未呈现明显的变化规律。

此外，十一烯醛、2-甲基-1-戊烯-3-酮和甲酸庚酯3个化合物仅在L1叶位检测到，含量分别为（1.62±0.03）μg/g、（6.16±0.23）μg/g和（10.23±0.41）μg/g;2-环戊酮化合物仅在L2叶位检测到，含量为（2.95±0.14）μg/g;3-羟基丁酮化合物仅在L7、L8叶位检测到，含量分别为（4.24±0.62）μg/g和（3.89±0.07）μg/g，而2-十四醇、十一醛、反-2-十二烯醛、2-十三（碳）烯醛和亚油酸等5个化合物零星分布于L2至L8叶位。

2.3  香露兜不同叶位叶片挥发性成分主成分分析

香露兜8个不同叶位与10个挥发性物质种类（图3A）和21种挥发性成分（图3B）的PCA分析表明，PC1和PC2前两个限制性轴的排序特征分别占總变异的97.73%和98.15%。由图3可见，香露兜8个不同叶位分为4类，L1叶位属于I类，L2、L3、L4叶位属于Ⅱ类，L5属于Ⅲ类，L6、L7和L8叶位属于Ⅳ类。其中，以3-甲基-2（5H）-呋喃酮为主的呋喃酮类和棕榈酸乙酯、甲酸庚酯为主的酯类与I类挥发性特征正相关;Ⅱ类富含叶绿醇、2-丁基-1-辛醇、3-甲基-2（5H）-呋喃酮、2-乙酰-1-吡咯啉、2，3-二氢苯并呋喃、新植二烯、角鲨烯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、2，4-二叔丁基酚等醇类、呋喃酮类、吡咯类、呋喃类、烯烃类、酯类、酚类等化合物，但不具有显著的特征挥发性成分;Ⅲ类挥发性特征主要由以3-甲基-2（5H）-呋喃酮为主的呋喃酮类、2-乙酰-1-吡咯啉为主的吡咯类、2，3-二氢苯并呋喃为主的呋喃类和角鲨烯、新植二烯为主的烯烃类化合物组成;而Ⅳ类主要由角鲨烯和新植二烯为主的烯烃类、2-乙酰-1-吡咯啉为主的吡咯类、2，3-二氢苯并呋喃为主的呋喃类、羟基丙酮为主的酮类等挥发性组分正相关。

3  讨论

香露兜为典型的热带香料作物，有“东方人的香草”之美誉，其特征挥发性物质2-乙酰-1-吡咯啉具有“粽香”风味，广泛用于面包、糖果、冰淇淋、奶酪和茶饮等食品行业[8， 13]。挥发性风味是衡量香露兜品质的重要指标。本研究以香露兜不同叶位叶片为材料，采用超声辅助无水乙醇浸提方法和GC-MS检测技术鉴定表明，香露兜挥发性物质由呋喃酮类、烯烃类、吡咯类、呋喃类、酮类、醇类、酯类、醛类、酚类和酸类10类化合物组成，这与Jiang[7]、Yahya等[14]和Laohakunjit等[8]的研究结果基本一致。同时，本研究进一步发现，呋喃酮类、烯烃类、吡咯类和呋喃类这4类挥发性成分相对含量约达80%，是香露兜挥发性物质组成的主要化合物种类。其中，呋喃酮类化合物挥发性成分相对含量约为36.62%，由L1至L8叶位整体呈现递减的变化规律;烯烃类和吡咯类挥发性成分相对含量分别为20.96%和13.65%，由L1至L8叶位整体呈现递增的趋势;呋喃类挥发性成分相对含量约为11.19%，由L1至L8叶位整体呈现先上升后下降的变化规律。

近年来，关于香露兜风味品质的研究主要集中在挥发性成分的鉴定分析。相关研究表明，香露兜地理分布、提取方法等因素影响挥发性成分的组成[15-16]。Wakte等[17]利用HS-SPME/GC-FID对香露兜鲜叶样品鉴定发现，2-已烯醛（21.87%）、壬醛（10.50%）、2-乙酰-1-吡咯啉（8.52%）和植醇（5.28%）等化合物是香露兜的主要挥发性成分。尹桂豪等[3]利用超临界CO2萃取技术鉴定香露兜挥发油，发现香露兜含有角鲨烯（21.03%）、β-谷甾醇（12.66%）等15种挥发性物质。任竹君等[4]采用正己烷蒸馏法鉴定出香露兜挥发性成分18种，主要挥发性成分是亚油酸甲酯（24.08%）和叶绿醇（18.85%），但未鉴定出2-乙酰-1-吡咯啉。同时，Mar等[5]采用水蒸馏法提取香露兜精油，结果表明植醇是主要的挥发性成分，含量高达21.35%，其次是檜酚酮（18.64%）、十二烷醇（12.55%）、正十四烷醇（8.93%）、乙酸苄酯（8.08%），但也未鉴定出2-乙酰-1-吡咯啉。与上述研究结果类似，本研究利用超声辅助无水乙醇提取法和GC-MS鉴定香露兜挥发性成分发现，香露兜富含2-乙酰-1-吡咯啉、3-甲基-2（5H）-呋喃酮、角鲨烯、植醇等。同时，本研究进一步发现，香露兜不同叶位叶片挥发性成分组成和含量存在一定差异。其中，倒1叶位挥发性主要由3-甲基- 2（5H）-呋喃酮、羟基丙酮、2-甲基-1-戊烯-3-酮、叶绿醇、亚油酸、2，4-二叔丁基酚、棕榈酸乙酯、甲酸庚酯等呋喃酮类、酮类、醇类、酸类、酚类和酯类化合物组成;倒2、3、4叶位富含叶绿醇、2-丁基-1-辛醇、3-甲基-2（5H）-呋喃酮、2-乙酰-1-吡咯啉、羟基丙酮、新植二烯、角鲨烯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯、2，4-二叔丁基酚等呋喃类、吡咯类、烯烃类、醇类、酮类、酯类、酚类等化合物，特征挥发性成分不明显;倒5叶位挥发性成分主要由以2-乙酰-1-吡咯啉为主的吡咯类、2，3-二氢苯并呋喃为主的呋喃类和角鲨烯、新植二烯为主的烯烃类化合物组成;而倒6、7和8叶位挥发性成分主要与角鲨烯和新植二烯为主的烯烃类、2-乙酰-1-吡咯啉为主的吡咯类、2，3-二氢苯并呋喃为主的呋喃类、羟基丙酮为主的酮类等挥发性组分正相关。

相关研究表明，2-乙酰-1-吡咯啉是“粽香”风味的主要贡献物质，在香稻[18]、香芋南瓜[19]、香水椰子[20]等植物以及爆米花[21]、面包[22]等加工食品中均有分布。2-乙酰-1-吡咯啉也是香露兜的主要挥发性成分[23]。本研究表明，不同叶位间2-乙酰-1-吡咯啉含量存在显著差异，其平均含量约（94.00±36.66）μg/g，远高于优质香稻（Yuliangyou）的含量（414.87～734.18 ng/g）[24]。本研究也检测到香露兜富含角鲨烯和植醇化合物。Maynard等[25]研究表明，角鲨烯具有增强细胞的活力及免疫力、抑制癌细胞生成及防止癌细胞扩散等作用。植醇是维生素E和维生素K1合成的基本原料，也是有机体氧化代谢的重要能量来源，具有良好的抗氧化作用，是用于预防癌症的潜在膳食化合物[26-27]。本研究发现，香露兜不同叶位角鲨烯含量为0～118.47 μg/g，且由倒1叶位至倒8叶位呈逐渐递增的变化趋势，倒8叶位含量高达（118.47±2.61）μg/g，与小米糠胚制油中的角鲨烯含量（102.45～126.22 μg/g）相当[28]。同时，香露兜不同叶位植醇含量为5.78～46.91 μg/g，且由倒1叶位至倒8叶位呈先升后降的变化规律，倒5叶位含量高达（46.91±0.38）μg/g。

综上所述，香露兜不同叶位之间的挥发性成分组成及含量均存在显著差异，植株叶片自顶端叶位（L1）至基部叶位（L8），其烯烃类、吡咯类挥发性成分含量呈递增的变化趋势，呋喃酮类化合物含量则呈递减变化趋势。各叶位含量最高的挥发性成分为呋喃酮类、吡咯类和烯烃类化合物。其中，倒5叶位为不同叶位特征挥发性成分变化的分界点，倒5、6、7、8叶位叶片富含较高的2-乙酰-1-吡咯啉、角鲨烯、新植二烯、植醇等特征挥发性化合物，应为香露兜采收的最佳叶位，也是风味品质最佳部位，适合食用和加工，以上研究结果将为香露兜标准化采收提供依据。

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