基于高通量测序技术的红枣黑斑病病原菌分离与鉴定

刘晓勤 张锐利

摘要：通过探究造成南疆红枣黑斑病的主要病原菌类别，为该病的靶向防治奠定理论基础。采用高通量测序技术和传统分离鉴定相结合的方法分别对南疆的喀什、和田、阿克苏等3个地区患病红枣黑斑部位进行病原菌鉴定。结果表明，从27个样品中获得91 137个高质量序列，其中相对丰度最高的菌门是子囊菌门，相对丰度最高的菌属是链格孢属（Alternaria），3个地区链格孢属的相对丰度分别是99.98%、98.15%、99.92%，其他菌属的相对丰度均在0.95%以下。通过对患病果实样品和代表菌株进行组织分离、形态学观察、分子生物学分析和病理学接种试验，明确造成南疆红枣黑斑病的主要病原菌是链格孢（Alternaria alternata），占85.6%。

关键词：南疆地区;红枣黑斑病;高通量测序;病原鉴定

中图分类号： S436.65  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2020）24-0108-04

红枣具有丰富的营养和药用价值，近年来已成为新疆农民增收致富的支柱型产业[1];然而，红枣黑斑病的发生严重阻碍了新疆红枣产业的可持续发展。该病害于2009年在新疆和田和阿克苏地区被发现，2011—2016年新疆枣园陆续被感染，发病率高达50%，部分枣园发病率高达70%[2]，给当地经济造成了严重损失，因此对引起红枣黑斑病病原菌的研究刻不容缓。

目前，对造成红枣黑斑病病原的鉴定还存在争议，林忠敏等研究认为，山西省红枣黑斑病病原菌为交链孢属（Alternaria）和茎点属（Phoma sp.）[2];靳增军等报道河北冬枣黑斑病病原物为毁灭茎点霉（Phoma destructiva Plowr.）和链格孢（Alternaria alternata）等2种[3];刘晓琳等研究认为，新疆部分地区红枣黑斑病病原菌为链格孢[4]，由此，推测地域不同可能造成红枣黑斑病病原的不同。

传统的分离鉴定方法在分析链格孢属形态特征复杂等问题时，准确鉴定菌属种存在一定困难和局限性[5]。近年来，高通量测序技术因耗时短、效率高、成本低、准确性高和针对性强等特点，广泛应用于土壤[6]、肠道[7]、叶片和果实[8]等领域。因此，本研究基于高通量测序技术进行预判后，结合传统鉴别方法[2-4]，有针对性地进行分离鉴定和回接验证，2种方法取长补短、互为印证，为后续拮抗菌的精准筛选和靶标防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

患病骏枣果实样品于2018年11月从南疆的喀什、和田、阿克苏等3个地区9个患病枣园采集，3个地区的编号分别为喀什地区J1、和田地区J2、阿克苏地区J3（表1）。

试验在新疆塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室进行。供试枣果为农一师十团骏枣成熟期果实，用于致病性测定。培养基有PDA培养基[9]、WA培养基[9]。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取和MiSeq测序 果实DNA的提取使用Fast DNA SPIN Kit for Soil试剂盒（MP），用NanoDrop-2000 测定DNA浓度，然后将质量合格的DNA样品送上海派森诺生物科技股份有限公司使用 Illumina （MiSeq）平台对真菌ITS 区进行双端测序。

1.2.2 数据分析 用DADA2方法进行去引物、质量过滤、去噪、拼接和去嵌合体，得到高質量的序列;用QIIME2 （2019.4）软件和R软件中ggplot2对测序结果进行数据分析。

1.2.3 病原物分离与纯化 对患病枣果实进行表面清洗消毒后，取患病枣果实病健交界处的果肉，采用组织分离法[10]分离菌株，后在培养基WA上进行纯化菌株，将纯化的菌株进行编号，置于-80 ℃保存备用。

1.2.4 致病性测定 从枣果黑斑病的分离物中挑选53T-3、50T-2、47T-2、224T-1、224T-7、HP-1、AH-2、3T-3和10T-5等9株代表菌株，通过离体菌块贴接法测定其致病力。将纯化后的菌株接种至PDA培养基在28 ℃条件下培养6 d，用无菌的1 mL移液枪头从底端打取生长较好的连同培养基一起的菌块;选取健康无外力损伤的枣果实，用无菌水清洗，后用75%乙醇进行表面消毒，在超净工作台中晾干;用无菌牙签刺孔，将菌饼的菌面朝下接种至枣果实刺孔处，同时用PDA培养基饼块作对照;将接有有菌菌饼和无菌饼块的枣果分别放入铺有湿润无菌棉的玻璃罐中，每株菌接种3个健康果实，接种完毕后置于28 ℃培养箱中，有光照和无光照12 h交替培养;每24 h观察记录果实表面变化情况，待6 d后对患病果肉部分进行菌株再分离。

1.2.5 病原菌鉴定

1.2.5.1 菌株形态观察 将病原菌的单孢菌株接于PDA培养基，28 ℃恒温光暗交替培养6 d，记录其形态特征，参照张天宇的方法[5]在显微镜下观察分生孢子、分生孢子梗、喙的形态和成链情况。

1.2.5.2 菌株分子鉴定 选取不同地区的9株菌，编号分别为53T-3、50T-2、47T-2、224T-1、224T-7、HP-1、AH-2、3T-3和10T-5;分别在培养基PDA上培养6 d，后用无菌一次性1 mL蓝色移液枪头底端打取菌块接种在PDA培养基上，28 ℃ 恒温条件下12 h白昼交替培养7 d后收集菌丝体，用试剂盒（TIANGEN Plant Genomic DNA Kit）进行基因组DNA提取。以菌株基因组DNA为模板，以Beta-F和Beta-R[11]为引物扩增代表菌株的β-tubulin基因;将PCR产物送生工生物工程（上海）有限公司进行测序，将测序结果在BLAST数据库中进行比对，获得同源性较高的菌株序列，通过MEGA6软件构建系统进化树，确定菌株亲缘关系，明确菌株分类学地位。

2 结果与分析

2.1 物种组成分析

从喀什、和田、阿克苏等3个地区27个样品中共获得91 137个高质量序列，各水平OTUs数量由高到低排列依次为和田地区>阿克苏地区>喀什地区（图1）;共检测出3个菌门分别是子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、被孢霉菌门（Mortierellomycota），其中子囊菌门（Ascomycota）是物种数量最多的菌门（表1），8个纲、12个目、15个科和19个属;3个地区相对丰度最高的菌属是链格孢属（Alternaria），相对丰度分别为喀什地区99.98%、和田地区98.15%、阿克苏地区99.92%，其他菌属的相对丰度均在0.95%以下（图2）;高通量测序结果表明，导致红枣黑斑病主要病原菌属为链格孢属。

2.2 病原物的分离结果

通过传统的组织分离法增加样品数量，从81份患病果实样品中分离获得90株分离物，依据菌落形态初步确定77株链格孢菌占85.6%，7株镰刀菌占7.8%，3株青霉菌占3.3%，3株其他菌占3.3%（表2）;因此，推测导致红枣黑斑病的主要病原菌是链格孢菌。

2.3 病原菌鉴定

2.3.1 形态学鉴定 将分离获得的53T-3、50T-2、 47T-2、 224T-1、224T-7、HP-1、AH-3、3T-3、10T-5等9株菌在PDA培养基上28 ℃条件下培养6 d，从图3-A、3-B可见，菌落颜色初期为白色，后逐渐变为灰色至淡褐色，边缘整齐;从图3-C、3-D 可见，分生孢子梗单生或簇生，或直或弯，淡褐色至褐色，（30.0～71.0） μm×（3.9～5.4） μm。分生孢子单生或链生，表面光滑，有横、纵隔膜，倒棍棒形或卵形，淡褐色至褐色，孢身（22.0～40.1） μm×（8.1～13.3） μm。依次对菌株的菌落、分生孢子梗和分生孢子所呈现出来的颜色变化、形态特征等参照文献[5]进行鉴定，初步鉴定其为链格孢（Alternaria alternate）。

2.3.2 分子生物学鉴定 通过传统组织分离后进行PCR扩增获得β-tubulin基因，后在数据库中进行比对构建系统发育树（图4），所有供试菌株与A.alternate聚在同一个单源分支上，同源性为99%。UPGMA聚类分析结果表明，3个地区的样品聚类在一起（图5）。图4、图5均表明导致南疆3个地区红枣黑斑病的主要病原菌是A.alternate。

2.4 致病性测定

将分离获得的代表菌株回接至健康的骏枣果实上，枣果在接种病原菌20 d后，接种部位开始形成病斑，呈黑色，病斑逐渐扩大（图6-B），接种病症与田间症状相同（图6-C），致病性测定结果表明，导致红枣黑斑病的主要病原菌是A.alternate。

3 讨论

目前，关于造成红枣黑斑病病原的研究报道较多;但可能因地域或品种不同，不同学者的研究结果各有不同。王军等鉴定了山东省部分县（市）冬枣黑斑病病原为细链格孢菌[A.alternata（Fr.） Keissler][12];宗淑萍等发现河北省冬枣黑点病病原菌为桑壳小圆孢菌（Coniothyrium Sacc.）、仁果茎点霉（Phoma pomirum Thum）以及细链格孢[A.alternata（Fr.） Keissler][13];包慧芳等研究认为，新疆部分地区红枣黑斑病病原为链格孢（A.alternata）[14]。本研究结果表明，针对南疆地区红枣黑斑病的病原研究很有必要。

因链格孢属种类多、形态特征复杂多变，传统的分离鉴定手段一部分主要依靠肉眼判断，主观性较强，一些细微差异可能被忽视，准确率降低。随着研究对象范围的扩大和数量的增加，传统的分离鉴定存在耗时长、效率低、成本高等局限性，在一定程度上影响了后续试验的深入开展，而高通量测序技术的应用[6-8]可弥补传统分离鉴定的不足，也为导致红枣缩果病等其他病害病原的准确鉴定和靶向防治提供思路。当然要想达到高效防治，还须对病原菌的生活习性、侵染时机以及发病条件等方面进行深入系统的研究。

本研究采用高通量测序技术和传统分离鉴定相结合的方式，对南疆喀什、和田、阿克苏等3大红枣产区患病枣园中患病骏枣进行样品采集，通过对病原物进行组织分离、形态学观察、病理学接种试验和分子生物学分析，结果表明，链格孢（A.alternata）为主要的病原菌，试验结果与向征等的研究结果[15-16]一致。

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