microRNA在乳腺癌细胞中的功能研究及其作为乳腺癌生物标志物的评估

夏赟，王清水，林尧

福建师范大学 生命科学学院，福建 福州 350100

乳腺癌是一种由于细胞增殖失控而引发的严重危及人类尤其是女性生命的疾病，每年都有大量女性因为乳腺癌病灶转移或复发而丧生。在所有女性恶性肿瘤中，乳腺癌的发病率是最高的。乳腺癌的病因与家族遗传因素、雌激素水平、基因突变和生活方式有关[1]。由于现代人的饮食习惯和工作压力，以及环境污染及各种食品添加剂等造成的激素分泌紊乱，使得乳腺癌的发病率每年呈上升趋势。乳腺癌具有不同的肿瘤间和肿瘤内非均匀性，并且在受影响的个体之间存在广泛的肿瘤差异。病灶转移是乳腺癌治疗失败和患者最终死亡的主要原因，乳腺癌细胞不断扩散，侵袭人体其他组织器官并引起机体衰竭，最终导致死亡。虽然乳腺癌的早期诊断和检测已经促进了死亡率的下降，但预防、检测和治疗方面的进一步进展对于改善乳腺癌预后和生存来说仍是迫切需要的。传统的乳腺癌治疗方法，如手术、放疗、化疗和激素治疗等，在早期乳腺癌的治疗中具有一定的疗效，但在治疗后的反应或感觉、毒性和耐药性方面不可避免地存在副作用。目前，寻找稳定有效、非侵入的生物标志物来准确诊断乳腺癌，以及寻求新的治疗乳腺癌的方法至关重要。近年来，microRNA（miRNA）因其在乳腺癌的发生、发展和转移中的调控作用而开始引起广泛关注。

1 miRNA及其在肿瘤发生中的作用

miRNA是一类内源性非编码小RNA，最初于上世纪90年代早期在秀丽隐杆线虫中发现。miRNA先通过转录产生pri-miRNA，后经切割成有循环结构的发夹状前体pre-miRNA，随后运输到细胞质中被剪切，得到成熟的miRNA[2-4]。这些与靶mRNA的3'非翻译区（UTR）结合的成熟的miRNA被认为可以调节至少30%的蛋白编码基因的表达[5]。

miRNA可以促进或抑制肿瘤的发生。例如miR-372具有通过下调抑癌基因LATS2的表达来控制胃癌细胞生长、细胞周期和细胞凋亡的致癌特性[6]；胆囊收缩素B受体（CCKBR）被miR-148b靶向并显著抑制胃癌细胞的生长[7]；miR-708-5p在非小细胞型肺癌中表达上调，并可能通过调控TMEM88促进肿瘤生长和疾病进展[8]；miR-30a-5p是非小细胞型肺癌发病机理中的关键调节因子，可调节非小细胞型肺癌的细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭，抑制肿瘤发生[9-12]。癌症与基因组改变之间的关联性揭示了miRNA在肿瘤发生中的作用，miRNA的异常表达同肿瘤的侵袭、转移和化疗耐药性相关，miRNA表达的变化会影响具有致癌或抑癌功能的靶mRNA编码蛋白的活性，进而影响肿瘤发生进程[13-14]。此外，某些miRNA的表达水平与乳腺癌的形态学特征、免疫组化、组织病理学参数、临床结局、预后及治疗反应密切相关[15]。这些研究表明miRNA在包括乳腺癌在内的癌症的诊断和治疗方面具有广阔的应用前景。

2 miRNA在乳腺癌中的研究

过去几十年，科研人员发现了许多在乳腺癌组织和正常组织中差异性表达的miRNA。同时，这些miRNA在乳腺癌病人和正常人的血清中的表达量有显著性差异。在乳腺癌细胞和健康人细胞中关于miRNA的研究也得到类似结果。这些结果预示着miRNA通过肿瘤抑制和致癌的机制在乳腺癌中发挥作用[16-17]。与乳腺癌相关的miRNA通过参与复杂的调控网络来调节乳腺肿瘤的某些特性，如维持生长和增殖信号、启动转移和入侵、抵抗凋亡、诱导血管生成、提高新陈代谢水平、支持细胞免疫逃逸等。

研究表明，miRNA通过与细胞周期蛋白家族、蛋白激酶及其抑制剂和其他生长促进因子或抑制因子的相互作用，在乳腺癌细胞的细胞周期进程中发挥调节作用，进而影响细胞增殖水平。细胞周期对于细胞增殖的调控至关重要。健康细胞的分裂代数和数量是有限的，而细胞分裂的数量很大程度上取决于细胞在组织内的最佳细胞密度。一旦达到一个有限的细胞密度，健康细胞将停止增殖。然而这种生理适应性的细胞周期阻滞机制在癌细胞中是异常的。Zhou等报道，miRNA模拟上调miR-143可以抑制细胞外信号调节激酶ERK5、丝裂原活化蛋白激酶MAP3K7和周期蛋白D1的表达，从而进一步降低乳腺癌细胞的活力，而抑制miR-143则可逆转这些作用[18]。Wang等研究表明，miR-455过表达可通过CDC2相关蛋白激酶CDK14和周期蛋白D1表达的双重抑制作用抑制乳腺癌细胞的增殖，并促进肿瘤抑制因子p21的表达[19]。

正常细胞的染色体或遗传信息的破坏可导致程序性细胞死亡信号通路的诱导，即引发细胞凋亡，以此作为一种防止细胞癌变的防御机制。但即使肿瘤细胞的遗传信息受到严重破坏，肿瘤细胞仍对凋亡反应具有抵抗性。细胞凋亡途径的任何一个特定点的破坏都可能触发乳腺细胞的恶性转化，提高细胞活力。研究表明，miRNA可以通过靶向或启动某些细胞凋亡途径的特定点，在乳腺癌复杂的凋亡调控机制中发挥重要作用。Sharma等发现促凋亡肿瘤抑制因子p53通过与miR-191-5p启动子区域的p53响应元件结合，转录下调了miR-191-5p的表达。在乳腺癌细胞中，过表达miR-191-5p导致凋亡小体数量减少和caspase-3/-7活性降低，而anti-miR-191-5p逆转了这一效应。此外，miR-191-5p水平的升高能够下调其潜在靶基因SOX4，从而进一步降低了p53在乳腺癌细胞中的表达，提示p53-mir-191-SOX4调控反馈回路的存在[20]。

癌症细胞具有松散的细胞基质相互作用，与非癌症细胞相比，它们对细胞外基质的黏附更少，从而使它们能够通过周围的血液或淋巴系统入侵或转移。研究表明，影响乳腺癌转移和细胞侵袭的某些miRNA的活性是由FOXP3和KAT2B诱导的。Zhang等发现，miR-200家族的2个成员，miR-200c和miR-141，都是由FOXP3诱导的，而KAT2B起协调作用[21]。随着肿瘤病情的发展，肿瘤会迅速扩展到现有的脉管系统之外，并导致形成一个比健康组织氧浓度低的肿瘤微环境，而这种肿瘤微环境是乳腺癌血管生成的关键调控因子。乳腺肿瘤的持续增殖和生长会引发新血管生成，从而为肿瘤提供氧气和营养物质，促进肿瘤进一步发展。miR-210是缺氧时最一致和最显著的诱导miRNA，Camp等对乳腺癌细胞进行了缺氧过程miRNA测序数据分析，检测到miR-210-3p 的上调[22]。

还有一些miRNA被发现在乳腺癌中发挥作用。例如，miR-99a既是癌基因FGFR3的调节因子，也是导致乳腺癌细胞增殖、侵袭和迁移显著减少的肿瘤抑制因子，血清miR-99a水平与临床结果相关[23]。此外，据报道miR-9与乳腺癌的复发和不良预后密切相关，也是乳腺癌诊断和预后的有前途的生物标志物。Bertoli等回顾了与乳腺癌发生和发展有关的miRNA，并证实miR-9正在成为乳腺癌诊断和预后的生物标志物[24]。Sporn等通过分析来自癌症基因组图谱（TCGA）的985例乳腺癌的数据，发现miR-9低表达似乎具有保护作用[25]。Li等报道，miR-29c通过靶向DNMT3B参与抑制乳腺癌的进展[26]。miR-196a被确定为通过靶向UBE2C来促进乳腺癌细胞生长[27]。除此之外，还有许多miRNA被发现与乳腺癌的发生有关。开发基于miRNA的新的生物疗法，可以为乳腺癌的治疗提供新的思路和方法。

3 miRNA作为乳腺癌生物标志物

由于miRNA与癌症发生相关，因此人们正在寻求miRNA标记作为新的临床诊断靶标，以进一步对乳腺癌进行分型，并预测转移或治疗耐药性。miRNA作为生物标志物靶标的潜力得益于其在血液中的稳定性，以及其承受反复冰冻和解冻循环的能力[28]。Iorio等发现miRNA-10b在晚期乳腺癌中表达水平较高，可作为乳腺癌的检测指标[29]。Biagioni等发现miRNA-10b基因位于染色体2q31.1上的同源盒D10（HOXD10）基因簇上，位于HOXD-4和HOXD-8之间的间隔中[30]。Ohuchi⁃da等提出miRNA-10b的主要靶基因HOXD10可以抑制多种实体瘤的转移[31]。与健康人相比，miRNA-10b水平在淋巴结转移性乳腺导管癌患者的血液循环中显著增加，提示miRNA-10b可以作为检测乳腺癌患者淋巴结转移的标志物[32]。在循环肿瘤细胞（CTC）患者中发现8种miRNA（miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-203、miR-210、miR-375 和 miR-801）显著升高[33]。在另一项研究中，与未转移的乳腺癌相比，早期转移的乳腺癌中发现了更高水平的miR-105[34]。研究还发现过表达miR-105可促进体内转移。miR-17和miR-155被认为是转移性和非转移性乳腺癌的潜在鉴别因子[35]。这些miRNA中的许多已经在转移性三阴性乳腺癌样本中被识别为标记物，突显了miRNA作为区分非转移性和转移性乳腺癌的生物标志物的重要性和潜在应用价值。目前，利用miRNA作为生物标志物进行可靠的临床检测仍然存在困难，还须深入的研究。

4 miRNA在乳腺癌诊断和治疗中的前景

使用miRNA进行癌症治疗的最大优势之一是它可以靶向涉及相似途径的多个基因[36]。以miRNA为靶点的治疗策略可能成为一种新的多途径的肿瘤治疗策略。例如，基于miR-9在乳腺癌中表达的特异性及其进入体液循环和稳定性的能力，可以检测人血、尿或胆汁中的miR-9水平，作为一种潜在的无创乳腺癌肿瘤标志物[24]。此外，基于miR-9的药物也是一种有前途的乳腺癌治疗方法。为了使miRNA在包括乳腺癌在内的多种癌症的治疗领域中更加成功，目前科学家正在探索改变合成miRNA的方法，例如通过改变某些结构元件，以便使其在体内更容易地转移至宿主细胞[37]。目前离miRNA能够实际应用到乳腺癌临床治疗和药物研发阶段还有一定的距离，基于miRNA的治疗方式和诊断方法被充分利用之前仍然存在诸多困难和挑战，因此还需要更多科研人员的努力。