基于微生物群体感应的固定化研究进展

陈天鹏，朱家庆，柳 东,3，陈 勇,3，应汉杰,3

(1.南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京 211800；2.南京工业大学 国家生化工程技术研究中心，江苏 南京 211800；3.江苏先进生物与化学制造协同创新中心，江苏 南京 211800)

20世纪40年代，发酵工业研究者建立了深层液体培养的现代发酵技术[1]，然而有关微生物催化反应体系方面的研究在近几十年来始终未有突破性进展。液体深层发酵依然存在如机械性损伤、液体环境不适、细胞生长稳定性差、易发生细胞衰亡和自溶等现象，致使生物催化剂的使用寿命难以取代化学催化剂，这也是目前生物发酵工业难以替代化学制造的主要瓶颈之一。

借鉴医学中致病菌会在医疗器械等处形成强抗逆性生物膜，结合笔者前期研究[2-3]发现，EPS(extracellular polymeric substances)体系中细胞自增殖、自修复和抗衰老能力在实现高效连续化生产过程中起着重要作用，细胞显示出集群效应、生命周期得到延长和抗逆性增强等特性。基于此现象，开发并建立以微生物集群效应形成EPS的固定化发酵系统并应用于多种化学品的生物制造将具有十分重要的意义。

本文中，笔者将重点叙述以EPS为催化剂的固定化发酵研究进展，寻找出生物膜形成的调控因子，重点阐述生物膜形成过程中基于信号分子介导的集群效应，为解决固定化发酵中出现的耐受性差和细胞易衰老等问题提供新的途径。

1 固定化发酵技术概述

固定化技术包括固定化酶技术和固定化细胞技术。固定化酶技术是通过物理或化学的方式将酶附着或封闭在不同基质材料的表面或内部的技术。酶固定化以后，一般情况下其活性和稳定性会提高。通常固定化载体含有多孔的结构，能为附着的细胞提供一个相对稳定的催化环境，有利于菌体的生长和繁殖。固定化载体主要分为两大类，一类是无机载体，如硅藻土、活性炭等；另一类是有机载体，包含天然凝胶载体和有机合成高分子凝胶载体。固定化细胞技术主要是通过将细胞约束在一定的空间范围内，使其既可以保持原有的催化活性，又可以被循环回收使用。目前，固定细胞的方法根据细胞固定原理的不同，主要分为四类：共价结合法、交联法、包埋法和吸附法[4]。Talabardon等[5]和Hui等[6]通过物理方法如吸附法和包埋法将真菌细胞固定在载体表面，证实可以高效分泌蛋白；Abdella等[7]在旋转纤维床生物反应器中采用重复批次发酵生产β-1,4葡萄糖苷酶最高产率达1.178 U/(mL·d)。

尽管材料和机械等行业的发展促使发酵装备和控制系统技术取得了长足的进步，但是由于固定化细胞存在的天然缺陷，细胞易出现机械性损伤、稳定性差和自溶等现象。自然界中，微生物在合适的固体表面集聚可产生群体效应，形成生物膜，以提高其整体适存能力，因此，解决此问题的最好办法是向自然界学习。

2 生物膜概述

生物膜(biofilm)是一种复杂的细胞群落，是细胞与细胞或非生物表面的相互关联[8]。在自然界中，90%微生物都可以形成生物膜，并且在极端条件下，微生物也具有生存能力，这些微生物具有较强的耐受性、抗逆性，在营养匮乏时也能生存繁殖。在宏观上，生物膜可看成是一层薄的黏液，它们具有独特的三维结构，是由细胞外基质形成的复杂的生物聚集体[2，8]。在医学领域，生物膜已被证实与医疗器械的污染相关联，从而导致各种疾病的产生和感染[9]。借鉴医学领域生物膜感染的现象，通过对生物膜感染的细胞机制的研究，同时发现生物膜对发酵工业生产中固定化细胞具有重要作用，细菌生物膜的相关研究将越来越受到重视。

生物膜的形成是一种动态的过程，在各个时期中，微生物表现出不同的存在形式，通过观察生物膜的整个形成过程，Sauer等[10]将其分成5个阶段。①初始黏附期：微生物细胞可逆地附着在非生物或细胞表面，通过菌毛、黏附素类的物质相互关联；②生长固着期：微生物细胞不可逆地附着在非生物或细胞表面，主要由胞外聚合物介导并与之相关联；③立体时空发展期：生物膜的早期发展成熟阶段，可以发现形成片状的生物膜，所占据的空间位置扩大，形成三维空间结构；④成熟期：生物膜的完全成熟阶段，在此过程中可以看到形成许多菌落，生物膜的结构稳定，对外界环境的抗逆性增强；⑤分散瓦解期：分散阶段，受到外界环境如营养、温度、pH和细胞内部信号途径的调控，生物膜破裂，单个细胞从聚集的群体中分散出来，回到最初的游离状态。有的假说认为分散出来的细胞们继续寻找合适的生存环境，进一步形成生物膜；而另一种假说认为分散出来的细胞已经完成它们的职责，自动结束生命过程，进入细胞凋亡状态[11]。因此，生物膜形成固有的三维空间结构是一个动态过程，涉及协调一系列的信号分子过程，包括细胞的黏附、聚集的细胞与细胞之间生存区域的扩张。

3 固定化细胞技术在生产中的应用

细胞固定化技术可使高活性菌体细胞聚集于特定空间并且快速生长繁殖，形成高强度催化体系，由此，发酵速度加快，产品得率提高。尤业兵等[12]采用海藻酸钙凝胶颗粒固定化酵母发酵产乙醇发现，乙醇收率随凝胶颗粒通透性的增加而增加，最终确定采用质量分数1.45%的海藻酸钠和17.45%的CaCl2，固定时间为1.09 h时，固定化酵母的乙醇收率达到24.1%，相较于游离酵母提高20%以上。海藻酸钙作为一种优良的固定化载体，同样还可应用于乳酸菌发酵生产L-乳酸。Givry等[13]采用海藻酸钙固定化发酵乳杆菌的策略生产乳酸，以半纤维素水解液为碳源，最终得到乳酸62.77 g/L，相较于游离细胞发酵提高了50%以上，收率也提高了76%，达到0.83 g/g；Shen等[14]以海藻酸钠凝胶小球固定化德氏乳杆菌发酵纤维素水解液生产乳酸，最终获得乳酸48.7 g/L，乳酸/葡萄糖的收率达到95.2%。宋威等[15]以海藻酸钠与聚乙烯醇混合制备高性能固定化载体，并确定当其比例为1∶ 2时，固定化细胞力学强度和化学稳定性达到最佳，在50 d内发酵的20个批次中，核酸酶P1酶活性稳定，保持在460 U/mL以上。

基于微生物集群效应开发的生物膜固定化技术是一种新型的吸附法。细胞吸附于载体后大量增殖，形成密集的菌群，进而显示出集群效应。集群效应使群体成员之间实现生理协同作用，提高整个种群的代谢活力和生存能力[16]。生物膜固定化方法克服了包埋、交联和共价结合法的缺点，既能使细胞聚集发挥作用，又不会对细胞本身的活性产生影响。Xue等[17]以纤维基质为固定化发酵载体，将拜氏梭菌CC101固定于其上，采取固定化耦合丁醇吸附分离工艺，发酵液中获得了54.6 g/L的丁醇，丁醇产率为0.45 g/(L·h)，且经后续分离后获得640 g/L的高浓度丁醇溶液；Xue等[18]还利用生物膜固定化发酵的原理，以丙丁梭菌JB200为出发菌株，经过78 h的发酵，丁醇达到19.1 g/L，葡萄糖消耗量为86.4 g/L，丁醇收率为0.21 g/g；Qureshi等[19]将拜式梭菌BA101固定于黏土砖颗粒上，生产效率达到15.8 g/(L·h)；Liu等[3]借助于丙酮丁醇梭菌能够吸附到载体形成生物膜的特性生产丁醇，提高细胞对丁醇的耐受性和产率，在重复批次发酵12 h内，丁醇平均质量浓度达到15.6 g/L，总溶剂产率1.88 g/(L·h)。通过筛选出相应的固定化载体，结合增强微生物形成生物膜的特点，可解决固定化细胞存在的诸如机械性损伤、稳定性差和自溶等天然缺陷的问题，对推动工业产品的高效清洁生产具有重要意义。

4 生物膜形成的调控因素

4.1 环境信号调控生物膜的形成

微生物生物膜的形成和扩散总是伴随着碳源和能量的消耗，微生物能感受环境中的营养种类和数量并对其做出反应。一些环境因子诸如葡萄糖、金属离子、气体分子NO等均能对生物膜的形成产生影响。

4.1.1 营养信号

葡萄糖是最易被微生物吸收与利用的碳源，对于金黄色葡萄球菌、链球菌和霍乱弧菌等来说，适当浓度的葡萄糖恰恰也是形成生物膜的强诱导剂[20]。在葡萄球菌中，培养环境中的葡萄糖通过诱导糖链合成基因的表达进而促进胞外线性葡聚糖物的合成，最终增强生物膜形成能力[21]。当培养基中葡萄糖过剩时，细胞中成膜的抑制因子被激活，生物膜的形成能力减弱；当培养基中葡萄糖不足时，生物膜形成能力增强，即贫营养环境能够诱导微生物形成生物膜。再者，如酿酒酵母的生物膜形成过程受到葡萄糖的抑制[22]，铜绿假单胞菌培养基的营养含量减少到最优培养基的10%时，能够诱导胞外多糖的合成，进而促进形成生物膜[23]。

4.1.2 金属离子

环境中常见的金属离子也会影响生物膜的形成。比如对于某些微生物，铁离子是其代谢途径中必不可少的微量元素，但在成膜过程中的作用却不尽相同。在金黄色葡萄球菌培养基中添加10 μmol/L铁离子会抑制其生物膜的形成[24]，但是对于表皮葡萄球菌，在低浓度铁离子环境下，生物膜形成能力反而增强[25]。因此，环境中的金属离子对微生物成膜能力发挥重要作用。

4.1.3 信号分子

微生物能够感受一些气体信号分子，NO可以调节微生物复杂的生理功能，不同浓度的NO对生物膜形成的影响不同[26]。高于3×10-7mol/L的NO浓度能够显著增强亚硝化单胞菌生物膜的形成，当NO浓度低于5×10-6mol/L时，浮游细胞的增多导致生物膜的消散[27]。随着NO浓度的升高，假单胞菌鞭毛以及鞭毛组装蛋白表达水平上调，从而增强了其生物膜的形成[28]。Yang等[29]通过观察低浓度NO对酿酒酵母生物膜形成的影响，确定了添加低浓度的NO供体可以促进固定化载体中酿酒酵母的生物膜形成，并通过转录组和蛋白质组学研究发现，生物膜的形成促进了细胞对乙醇的耐受性，为基于酵母生物膜形成的乙醇连续批次发酵工艺提供理论支持。除此以外，NO还能通过影响二鸟苷酸环化酶和磷酸二酯酶的相对活性调控胞内环二鸟苷酸(c-di-GMP)的水平，例如在NO作用下，假单胞菌中的趋化转导子BdlA诱导分解c-di-GMP的磷酸二酯酶的表达，促进其分解，从而调控生物膜的扩散[30]。

由于自然环境的复杂性，目前对环境因子诱导生物膜形成的研究较少，大多数研究仅停留在发现某种环境因子诱导生物膜相关基因的表达。深入研究特定环境因子及其信号转导途径调节通路，将为生物膜的防控和利用奠定理论基础。

4.2 群体感应系统调控生物膜的形成

微生物在合适的固形物表面集聚即可产生群体效应，以提高其整体的适应生存能力。研究发现，微生物在固体表面吸附聚集后，会合成大量多糖、蛋白等胞外聚合基质——EPS，从而将自身细胞包埋其中，实现细胞群落在固体介质表面的长期定植[9]。EPS为细胞隔离外界毒性物质提供了一道天然屏障，提高了EPS中微生物细胞的抗逆能力，因此，细胞在EPS中能够大量增殖形成密集的菌群进而展示集群效应[31-33]。近年来的大量研究均致力于削弱一些致病微生物如致病性大肠杆菌和铜绿假单胞菌的群体效应，以消除生物膜的形成，这也解释了微生物形成生物膜对治疗药物和宿主免疫反应的抵抗性[34-35]。在真菌中，群体感应被证实参与单细胞和丝状生长之间的转换[36]。在酿酒酵母中，芳香醇如苯乙醇通过Ras-cAMPK蛋白激酶Tpk2p诱导FLO11表达[37]，进而诱导其生长富集；β-吲哚乙醇通过诱导FLO1表达使菌体絮凝[38]。此外，芳香醇也会刺激其他转录因子如Mig1p和Cat8p，进而调控不同的胁迫反应，使基于群体感应效应的高密度酵母发酵可以表现出较强的耐受性和催化活性[39]。微生物间通过分泌、释放一些特定的信号分子感知浓度变化，检测菌群密度、调控菌群生理功能，除了芳香醇介导的群体感应之外，还包括其他信号分子诸如信号分子AIP(分泌环肽)介导的agr群体感应系统和信号分子c-di-GMP介导的群体感应系统。

4.2.1 附属基因调节子agr群体感应

agr(accessory gene regulator)系统是革兰氏阳性菌中的群体感应系统，由RNAII和RNAIII两个单元组成。agrD基因编码前信号肽AIP，经由膜蛋白AgrB剪切AgrD合成的多肽，形成长度为8个氨基酸的硫内酯环结构，成为成熟的AIP，并运输出细胞膜外。膜感应蛋白AgrC和反应调控蛋白AgrA构成一个双组分调控系统。当胞外AIP达到一定临界值，就可磷酸化或去磷酸化来改变AgrA活性，进而启动P2启动子和RNAIII启动子P3的表达，形成一个正向的反馈循环和RNAIII的转录。在表皮葡萄球菌中，编码黏附因子的基因atlE被agr群体感应系统通路上调，从而增强了生物膜的形成[40]。agr也能够通过调节蛋白酶和DNases来影响生物膜的形成。生物膜的形成与消散模型中，第五步agr介导的解离需要胞外蛋白酶活性的增强[41]。解离也包括DNase I对eDNA的降解，而eDNA在生物膜的形成过程中起到“蜘蛛网”和“脚手架”的作用[42]。

4.2.2 信号分子c-di-GMP介导的群体感应

第二信使c-di-GMP于1987年首次被发现，其功能是促进菌体合成纤维素[43]。近年来的研究发现，c-di-GMP在细菌中普遍存在，并具有调控细菌运动性、致病性、生物膜的形成、细胞衰亡和细胞周期等生命过程的作用[44]。c-di-GMP通过调控细菌鞭毛及菌毛蛋白的合成控制细菌游动翻转运动等。例如高浓度的c-di-GMP会使细菌在基质表面静止状态，低浓度的c-di-GMP则促进细菌的运动。目前广泛认同的调控模式为：当胞内c-di-GMP含量较高时，胞外多糖合成增多，细菌表面黏附特性和细胞集群性增强，生物膜形成增强；当胞内c-di-GMP含量较低时，菌体以浮游状态生存[45]。

在细菌细胞中，2分子三磷酸鸟苷(GTP)在二鸟苷环化酶(DGC)的催化下合成c-di-GMP。c-di-GMP的降解则通过磷酸二酯酶(PDE)的催化重新形成2分子GTP进行。DGC含有保守的GGDEF结构域，而PDE含有保守的EAL或HD-GYP结构域。其中EAL催化结构域能将c-di-GMP降解为pGpG，随后再被降解为2分子GMP；而HD-GYP催化结构域能将c-di-GMP直接降解为GMP[46-47]。在对不同细菌的基因组的DGC和PDE保守结构域序列进行预测发现，大多数细菌广泛含有多个DGC和PDE酶编码基因，例如在大肠杆菌中有34个，沙门氏菌有27个，霍乱弧菌有63个，铜绿假单胞菌有39个，工业生产菌株丙酮丁醇梭菌有22个[48-49]。这可能是因为菌体的生存环境复杂时，需要更多的DGC和PDE来组合响应不同的环境信号，进而精确调控胞内c-di-GMP含量，使菌体更适应复杂的生存环境[50]。

c-di-GMP调控下游表型的方式有3种。①c-di-GMP可作为核糖开关：它能通过直接与mRNA的核糖体结合位点结合、调控mRNA的转录和翻译，进而控制基因的表达[51]。②c-di-GMP的受体蛋白为转录因子：c-di-GMP可通过直接与转录因子结合的方式激活或抑制转录因子调控转录的能力，从而调控下游靶基因的表达。如在铜绿假单胞菌中，c-di-GMP通过结合鞭毛调控蛋白FleQ，抑制了FleQ的ATP酶活性，引起其构象的变化，使FleQ不能调节下游鞭毛基因，将细菌从浮游状态切换至生物膜状态[52]。鞭毛功能的抑制将稳定细菌与介质表面的相互作用，促进菌体向不可逆附着的转变，形成成熟的生物膜。③c-di-GMP的受体蛋白为激活/阻遏蛋白，通过调控其靶蛋白的活性展示其功能：在荧光假单胞菌中，当c-di-GMP浓度较低时，蛋白酶LapG能够剪切LapA，致使其降解，细胞失去黏附蛋白，菌体吸附能力下降，处于浮游状态。荧光假单胞菌的细胞表面蛋白LapA是导致不可逆黏附的关键蛋白。另外有学者观察到在铜绿假单胞菌PAO1中过表psl基因后，细胞内c-di-GMP异常升高，随即在培养基中加入纯化后的Psl蛋白也发现了这样的现象，于是得出结论：Psl蛋白(而不是psl基因的表达)刺激c-di-GMP的产生[53]。利用高分辨率显微镜和单细胞追踪研究发现，Psl蛋白对生物膜形成的促进作用表现为：促进浮游细胞并入生物膜和/或附着于表面；维持微菌落或大菌落结构。

目前通过细菌基因组的鉴定和比对，能够找到相对数目较多的DGC和PDE，但是对它们所响应的环境因子信号和胞内交流信号还缺乏研究，并且c-di-GMP的受体蛋白较难寻找。如果能够解决这些问题，将有助于全面了解c-di-GMP调控生物膜形成的信号转导途径。

5 结论与展望

1)针对生物膜固定化发酵系统，基于细胞和材料界面的作用机制，设计和开发具有更好的EPS诱导作用的固定化载体，从典型的真核生物如酵母和霉菌，原核生物如丙酮丁醇梭菌、大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌出发，探索不同细胞对不同介质之间结合的设计策略；2)针对不同微生物细胞的生理特点，建立强化EPS合成、优化其功能的分子调控方法，挖掘操纵细胞增殖的基因和蛋白；3)针对细胞间存在的信号传导系统，强化基于EPS合成的集群效应的可行性，实现EPS催化体系在多种工业化学品制造过程中的应用。

目前对生物膜形成过程中基于信号分子介导的集群效应的机制研究尚存在不足，但可以确定的是，若能从分子和代谢层面揭示生物膜体系中细胞增殖和修复的现象和规律，探索生物膜中信号介导的细胞集群效应及其对生物催化体系的影响，将为解决固定化发酵中出现的耐受性差和细胞易衰老等问题提供新的途径，对推动工业产品的高效清洁生产具有十分重要的意义。