食品中四环素残留检测方法比较分析

曹丁丁，陆利霞，熊晓辉

(南京工业大学 食品与轻工学院，江苏 南京 211800)

四环素类药物(TCs)属于广谱抗生素类，不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、厌氧菌、螺旋体、支原体有良好的作用，还对衣原体和立克次体等微生物具有很强的抑制效果[1]。常见的四环素类药物主要包括四环素(tetracycline，TC)、土霉素(oytetracycline，OTC)、金霉素(chlortetracycline，CTC)和强力霉素(doxycycline，DC)[2]，其中四环素的使用最为广泛。由于四环素使用剂量过大、用药时间过长，其在食品中的残留十分严重，导致严重后果：一方面危害人体健康，另一方面，低浓度的四环素残留容易诱导致病菌产生一定的耐药性，对人类和畜禽类疾病的治疗效果产生较大影响[3-5]。

随着科学技术的飞速发展，四环素的检测方法正在逐步增多和完善，如电化学适配体传感器[6]、荧光传感器[7]、表面增强拉曼光谱[8]和高效液相色谱[9]等技术都已被广泛使用，本文中，笔者就四环素常用检测方法的原理及优缺点进行综述，并就目前存在的问题和未来的发展趋势进行总结和展望。

1 四环素的常用检测方法

1.1 电化学适配体传感器(electrochemical aptasensor)

电化学适配体传感器是一种以适配体作为分子识别的接受器，通过固定化技术将其结合到感受器表面，进行特异性识别，生成适配体-目标分析物复合物，与产生的信号相关联，利用换能器转化为可测定的电化学信号，从而以电化学信号为变量，实现对目标分析物的定量检测[10]。与色谱法、免疫法等相比，该方法灵敏快速、简单新颖，低成本、高收益。但是，此类传感器寿命不长，且需定时补给电解液，比较麻烦，因此还未大面积广泛使用，仍在探索中。

Tang等[11]通过将特定的DNA适配体与新型二氧化钛(TiO2)纳米复合材料相结合，开发出基于新型二硫化钼-二氧化钛@金纳米颗粒(MoS2-TiO2@Au)三元复合材料的超灵敏和特异性电化学发光传感器。该传感器中使用的三元复合材料明显优于其他二元材料，其协同效应促进了性能的改善，在牛奶样品中已经能够实现定量检测，线性范围为1.5×10-10～6.0×10-6mol/L，检出限为5×10-11mol/L，回收率为90%～97%，能够很好地实现快速高通量检测，是未来四环素检测的选择之一。

传统的电化学传感器一般仅能实现单一样品的测定，各批次样品间会出现差异较大、准确度较低等情况。Xu等[12]基于二茂铁(Fc)和碳纳米纤维(CNF)开发出一种比例式电化学适配体传感器，通过电流变化比率进行测定。该传感器很好地解决了此类问题，利用比值计算的优势，在10-8～10-3g/L范围内定量检测四环素，检出限为3.3×10-7g/L。同时，在对牛奶样品的适用性方面，与超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)测定的值有极好的一致性，表明在食品安全检测中具有很大的应用潜力。

由于阻抗技术(电化学阻抗谱(EIS))的独特性质和通过恒定电位电聚合对电极表面进行修饰，Benvidi等[13]使用多壁碳纳米管(MWCNTs)和电聚合的聚(L-谷氨酸)构建了高灵敏的电化学适配体传感器，结果发现，在最佳条件下，与Tang等[11]和Xu等[12]研发的电化学传感器相比，该传感器线性范围低至1.0×10-16～1.0×10-6mol/L，检出限低至3.7×10-17mol/L，取得了突破性进展。目前已实现蜂蜜类样品的检测，稳定性高、分析时间短、成本低且可多次重复利用。

禽肉类样品中四环素的检测一直是困扰科研工作者的难题，但He等[14]以硫堇为电活性探针，制备了基于羧基官能化多壁碳纳米管和金纳米颗粒复合物(COOH-MWCNTs/AuNPs/CS/Apt/AuE)的敏感电化学适配体传感器，实现了禽肉类样品中四环素检测质的飞跃。在最佳条件下，线性范围为10-10～10-3mol/L，检出限低至6×10-11mol/L，以鸡肉样品为基质检测时，回收率范围为98%～109%，为现场检测提供了一个很好的范本。

1.2 荧光传感器(fluorescence sensor)

荧光传感器是利用荧光探针为载体制备的一种新兴的传感器，相比于其他方法而言，该法灵敏度好，检出限低，能够实现微量检测[15]。此外，荧光传感器还能实时在线检测，具有解决实验单一性问题、细胞毒性小、可测定活细胞内不同部位的底物浓度等优点。但荧光传感器易受一些难以定量的可变因素干扰，且难以实现非常精确的检测，此类问题仍在进一步的研究中[16]。

Sun等[17]建立了一种基于四环素结合适配体和噻唑橙(TO)的无标记荧光适配体传感器，TO作为荧光探针能够与具有G-四联体结构的四环素结合适配体结合，并产生强烈的荧光发射。在最佳条件下，该法线性范围为0.05～100 μg/mL，检出限为0.029 μg/mL。与其他研究相比，该法不需要对适配体或复杂仪器进行任何修饰，检测过程方便、均匀，在简单混合后可直接对四环素的存在作出反应。该法用于检测原料乳样品时，回收率90%～108%，时间小于1 h，为将来其他样品的快速筛选奠定了基础。

Sun等[17]的方法虽然能够对原料乳中四环素进行快速测定，但是视觉检测的可视化程度并不显著。Xu等[18]通过制备嵌入坡缕石(Pal)的染料分子作为荧光参照物，使用铕离子(Eu3+)作为潜在的红色发射种子，开发出一种用于检测四环素的比率荧光纳米探针。在牛奶样品的定量检测中，检出限为7.1 nmol/L，回收率为98.75%～106.04%，相对标准偏差(RSD，n=3)均小于3.12%。尤其是牛奶样品中肉眼可以观察到多色荧光，裸眼最低可检测浓度(LDC)低至约100 nmol/L，分别低于美国食品药品管理局(FDA)和欧盟(EU)设定的牛奶中300 ng/mL[19](676 nmol/L)和100 ng/mL[20](225 nmol/L)四环素的最大残留限量(MRLs)。此外，该纳米探针的固定化测试纸通过使用智能手机和易于访问的彩色扫描APP作为检测平台，实现了四环素实时分析，有着广泛的应用前景。

无酶、无标签的荧光检测方法深受科研学者的关注。Zhou等[21]基于催化发夹组装和G-四链体DNA置换的新型信号放大策略，建立了一种无酶、无标签荧光适配体传感器，可检测牛奶中的四环素、土霉素、金霉素和强力霉素等4种四环素类药物。在最佳条件下，该法线性范围为0～1 000 μg/L，检出限为4.6 μg/L。与其他方法相比，该荧光传感器对目标分析物与其他常见的不匹配兽药具有高度的鉴别效率，未来可应用于食品中其他四环素类药物的检测。

1.3 表面增强拉曼光谱(surface enhanced raman spectroscopy，SERS)

表面增强拉曼光谱克服了传统拉曼光谱自身信号微弱的问题，可使待测物的拉曼信号增强106～1015倍[22]，从而达到提高灵敏度的效果。然而，现有的SERS 技术很难进行定量分析，且稳定性不够好，该项技术还可进一步完善。

Li等[23]开发了一种基于SERS的磁性纳米球-靶向多功能方法，该方法将对巯基苯胺(PATP)嵌入的核/壳纳米粒子作为标记，并以磁芯/壳纳米球作为元素识别单元，用于目标四环素的检测。金(Au)核和二氧化硅(SiO2)硅壳之间的锚定报告分子成功地避免了外部条件的干扰，从而提高SERS信号的稳定性和再现性，RSD分别为6.61%和5.58%。在最佳条件下，释放互补DNA-Au/PATP/SiO2(cDNA-APS)样品的四环素浓度与SERS强度之间的相关性为0.001～100 ng/mL，检出限为0.001 ng/mL，显著扩大了检测范围，具有良好的实用价值，已用于牛奶样品中的掺假检测。

现有的SERS技术很难进行简单的现场检测，但Dhakal等[24]使用定制的便携式785 nm拉曼光谱系统与银胶体纳米颗粒共同检测浓度为1 000、500、100、10、1.0、0.1和0.01 mg/L的牛奶中的四环素，实现了现场检测零的突破。在牛奶-四环素溶液中观察到四环素振动模式为1 621、1 322 cm-1(分别从1 632、1 317 cm-1移动)。该溶液中检测出的四环素残余物浓度均低至0.01 mg/L。此外，在使用1 322和1 317 cm-1的峰强度来估计牛奶中四环素的浓度时，牛奶的相关系数为0.88。由此看出，这种SERS方法为今后在现场生产中四环素的定性和定量检测奠定了基础。

肉类食品中四环素残留的SERS检测目前已取得了较大的进展。Zhao等[25]提出了基于表面增强拉曼光谱(SERS)的快速检测方法，实现鸭肉中四环素残留的检测。该方法中，预处理简单快速，使用1 558和1 272 cm-1的SERS强度比(I1272/I1558)建立SERS校准曲线，鸭肉提取物中四环素的浓度与I1272/I1558呈良好的线性关系，线性回归方程和相关系数(r)分别为y=0.017 7x+0.121 3和0.950，检出限为1.120 mg/L，四环素的平均回收率为101%～108%，RSD为2.4%～4.6%，为禽肉中四环素的检测方法提供了有力的保障。

1.4 高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)

高效液相色谱法是一种常用的色谱分析技术，由于操作时间长，分析成本高，已逐渐被其他方法所取代。为了克服这些不足之处，国内外科学家研发出快速、简便的前处理方法与其相结合，达到了非常理想的效果。

现阶段，常见的前处理方法有液-液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)[26]、固相萃取(solid-phase extraction，SPE)[27]和基质辅助固相分散萃取(matrix solid-phase dispersion，MSPD)[28]等。近年来，液-液萃取由于费时、选择性差、溶剂消耗多以及易发生乳化现象等不足而逐渐被固相萃取所取代，但液-液微萃取(liquid-liquid micro-extraction，LLME)[29-30]作为一种新型微萃取技术逐渐发展起来，该方法简单易行、耗时短、结果准确且环境友好，取得了较大进展。

Xu等[31]开发了一种新型中空纤维膜基动态液-液微萃取(HF-DLLME)与HPLC-UV检测相结合的方法，用于检测牛奶样品中四环素的含量，不进行脱蛋白和脱脂。与常用的固相萃取(SPE)方法相比，用于柱激发和洗脱过程的有机溶剂被分离出来，立即分析受体溶液。该方法主要消耗的材料是HF膜，成本明显降低。该法检出限低(0.95～3.6l g/L)，动态线性范围宽，加标样品的回收率范围为92.38%～107.3%，RSD低于8.66%，这是之前所有研究都未能达到的。这些数据表明HF-DLLME在分析存在于环境和生物样品中的低水平两性药物方面有着非常光明的前景。

此外，磁性固相萃取(magnetic-solid phase extraction，M-SPE)[32-33]也在进一步开发中。与常规固相萃取(SPE)填料相比，纳米颗粒比表面积大，扩散距离短，低浓度的微量萃取只需很少吸附剂和很短平衡时间就能实现。磁性颗粒也可以很容易地通过外加磁场从待测体系中分离和收集，避免了繁琐的过滤或离心过程。

Zhou等[34]制备了亲水性聚合物刷磁性微球(HMMs)，采用磁分散固相萃取(MDSPE)-高效液相色谱法(HPLC)测定蜂蜜中四环素类药物的残留。该方法检出限和定量限分别为1.92～2.56 μg/kg和6.40～8.53 μg/kg，，在0.05、0.10和0.20 mg/kg的加标水平下，四环素(TC)、金霉素(CTC)和强力霉素(DC)的回收率为85.8%～94.5%，RSD为1.6%～4.4%，能够用于生物、食品和环境样品等复杂基质样品中四环素类药物的分离富集和净化。

Wei等[35]基于氧化石墨烯/纳米零价铁(GO/nZVI)的磁性固相萃取(MSPE)实现了水和牛奶中四环素等6种四环素类药物的痕量测定。该方法对于水和牛奶样品低定量检出限为8.05～83.19 ng/L和17.42～182.75 ng/L，加标回收率为84.2%～105.5%，首次实现了水样和牛奶样品中的多种微量四环素类药物的痕量检测，大大减少了检测时间和精力，为实现现场快速测定提供了强有力的选择。

1.5 近红外光谱(near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS)

近红外光谱是指介于中红外光与可见光之间、波长范围为780～2 526 nm的电磁波。近红外光谱分析技术具有快速、无损、可在线分析等优势，广泛应用于农业、化工、制药和食品等许多行业的检测中[36]。但是，近红外光谱吸收强度弱，有效信息率低，分析难度高，操作相对复杂。

Wu等[37]将近红外光谱技术(NIRS)与偏最小二乘法(PLS)方法相结合，研究开发出一种可用于测定牛奶中四环素的方法。该实验中，将纯牛奶和掺假牛奶各40份样本正确地分配到100%准确度的校准集中，在预测集中获得了96.3%的正确分类率。定量掺假牛奶中四环素的含量时，校准和预测模型的均方根误差分别为0.61和4.22 mg/L。相比较而言，这种基于近红外光谱的方法能够区分出四环素掺假牛奶来作为高效液相色谱的补充，从而提高检测效率。该法中联用的PLS模型对于校准集中拟合效果良好，但对于低浓度样品，预测能力相当有限。

因此，该方法还需进一步的整合和改善。相信不久的将来，随着近红外光谱技术的发展，灵敏度和检出限会更为精确，能够更好地应用于四环素的检测当中。

1.6 酶联免疫技术(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)

酶联免疫技术现已广泛使用，可进行定量或者定性分析。此方法可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，同时，酶的催化效率很高，能够间接放大免疫反应的结果，提高反应灵敏度。与传统的免疫学方法相比，特异性更高，检测结果更为准确。

Jayalakshmi等[38]用竞争性间接化学发光酶联免疫分析(CL-ELISA)法进行肉、牛奶和鸡蛋中四环素类残留物的测定。CL-ELISA的灵敏度比常规ELISA高2～3倍，测定牛奶中四环素的含量时，在133份牛奶样品中，发现18份样品含有四环素，质量浓度在16～134.5 μg/L范围内，实现了快速、简便的精准测定。

Korkmaz等[39]用竞争性酶联免疫测定法检测59份天然松木蜂蜜样品中四环素的残留。59份样品中有35份发现了四环素残留，线性范围为6～42 μg/L，24份样品中的水平低于检测水平(<4 μg/L)。相比较而言，该方法的检测范围更为精确，达到10-9级，同时，操作也更为简单，价格更为低廉，有着非常良好的应用前景。

此外，ELISA也可应用于食品中多种四环素类药物的同时检测。Chen等[40]开发出一种敏感的四环素类特异性单克隆抗体，用酶联免疫技术和免疫层析法检测牛奶和蜂蜜样品中的四环素、土霉素和金霉素的残留量。该方法检测出四环素的线性范围为0.26～2.00 μg/L，四环素、土霉素和金霉素的半抑制浓度(IC50)为0.72、3.2和6.4 μg/L，牛奶样品中三者的回收率为82%～102%、91%～105%和90%～101%，蜂蜜样品为88%～101%、89%～101%和89%～95%。免疫层析法测定时，牛奶中三者的截断值(即判断标准，是判定试验阳性与阴性的界值，用来区分某项指标的正常与异常)为15、15和50 μg/L，蜂蜜中为40、40和40 μg/L，可提供半定量结果用于判定残留量是否高于检出限，具有很强的创新性和较大的实用价值。

1.7 表面等离子体共振(surface plasmon resonance，SPR)

表面等离子共振一般不需要对样品进行处理，且所需样品量极少，一般一个表面仅需要1 mg蛋白。此外，SPR传感技术可实时、定量检测样品，方便、快捷地获得高通量、高质量的分析数据，具有独特的优势[41]。

Wang等[42]选择典型的小分子四环素(Mw444.4 g/mol)作为模型，将适配体技术、DNA纳米结构和Biacore T200 SPR仪器结合起来，开发出一种简单的SPR适配体传感器。检测蜂蜜样品中的四环素残留时，检出限为0.006 9 μg/kg，比常规HPLC分析所需的检测水平(mg/kg)高出许多个数量级。回收率为80.20%～114.3%，明显优于其他方法，充分显现出SPR技术的高效性和准确性，可作为未来四环素检测的有力选择。

然而，现阶段已有的SPR传感技术与传统分析手段相比，尤其是免疫检测手段，在检测成本、易用性、稳定性和检测效率等方面还存在许多不足，这种现状决定了该技术还有很大的发展空间，在研发和检测方面还需进一步改善。

2 不同四环素检测方法的特点比较

电化学适配体传感器和荧光传感器技术是目前研究者的热点，这两类传感器不仅快速灵敏、简单新颖、低成本高效益，而且能够实时在线检测、重复利用，有很强的创新性和借鉴价值。表面增强拉曼光谱技术[43]是一种无损检测技术，能够有效避免误差，但是现有的检测技术难以定量，稳定性还需加强，仍有一定的发展空间。高效液相色谱法是研究中最常用的检测方法，高效、快速、易于测定，但前处理比较复杂，现已进行优化，操作更为简便。酶联免疫法比较完善，可用于定量或定性检测，且能与其他多项技术相结合，但是由于存在一定的交叉反应，因此不适合作残留确证，而适用于快速筛选。近红外光谱和表面等离子体共振技术与其他方法相比，检测成本高、分析难度大，稳定性方面也有待加强，需进一步改善才能更好地普及和投入实际样品的检测。

3 结论与展望

随着社会的发展和科技的进步，四环素的残留问题已然成为食品安全的重大问题之一，越来越多的研究学者致力于此类药物检测方法的制备和完善。目前国内外标准中所采用的检测方法都存在不足之处，且检测的样品种类较为局限，操作更加方便、灵敏度更高的方法亟待开发，从而保证民众的身体健康和环境安全。

现如今，四环素的检测方法正朝着快速、简单、有效、新颖的方向发展，进一步降低检出限和拓宽动态范围已经势在必行。然而，这还需解决一些已经存在的问题。例如，表面增强拉曼光谱、荧光传感器等方法难以进行精确的定量测定，需要与高效液相色谱等其他方法进行多级联用，这在一定程度上加大了检测的难度，也增加了耗费的成本。近红外光谱等方法有效信息率低、分析难度大，技术设备还需改进和完善。此外，很多方法目前只在试行阶段，未能投入到实际样品的检测，进一步改善和优化迫在眉睫。这些问题的存在预示着会有更先进、更精确的技术引入，如纳米技术、高通量传感器技术和换能检测技术等，在不久的将来一定会实现四环素更灵敏、更稳定的检测。