蒋耀瑛,霍湘芸,董子钰,范晓越,黄志伟,王岁楼
(中国药科大学工学院,江苏南京 211198)
石楠叶,新鲜红叶石楠绿叶片,2018年4月采摘于中国药科大学江宁校区食堂门口。选择颜色明艳、大小均匀、形状完整的叶片,洗净沥干水分后,于烘箱内40℃下烘干,恒质量后真空干燥1 h,然后粉碎、过100目筛,避光保存。
主要试剂:丙酮、乙酸乙酯、石油醚、正己烷、无水乙醇、β-胡萝卜素、氧化铝、硅藻土等,均为分析纯试剂;柱层析硅胶,100~200目。
主要仪器:DFY-500型高速中药粉碎机、DZF-6050型真空干燥箱、TU-1810型紫外-可见分光光度计、HH-8型数显恒温水浴锅、TGL-16G型高速台式离心机等。
准确称取1 g红叶石楠绿叶粉末,以一定料液比加入提取溶剂,在一定温度下提取一定时间,离心得上层清液即为粗提液。
(1)料液比的影响。丙酮为溶剂,分别称取1.0 g粉末于试管中,温度40℃,料液比1∶10,1∶15,1∶20,1∶25,1∶30条件下暗处水浴密封提取2 h。于波长450 nm处测定吸光度。
(2)提取时间的影响。以丙酮为溶剂,分别称取1.0 g粉末于试管中,提取温度40℃,料液比1∶20,暗处水浴密封提取1.0,1.5,2.0,2.5 h。于波长450 nm处测定吸光度。
(3) 提取溶剂的影响。选用无水乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、丙酮∶石油醚(1∶2),丙酮∶石油醚(3∶7),丙酮∶乙醇(1∶1) 为溶剂,分别称取1.0 g粉末于试管中,料液比1∶20,温度40℃,暗处水浴密封提取2 h。于波长450 nm处测定吸光度。
(4)提取温度的影响。丙酮为溶剂,分别称取1.0 g粉末于试管中,料液比1∶20,分别在温度30,35,40,45,50℃下暗处水浴密封提取2 h。于波长450 nm处测定吸光度。
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(5)正交试验。红叶石楠叶类胡萝卜素分离的正交试验采用四因素三水平L9(34)的设计方法。
提取正交试验的因素与水平设计见表1。
表1 提取正交试验的因素与水平设计
选用一定的吸附剂和洗脱剂湿法装柱,加入1 mL类胡萝卜素粗提液,用一定洗脱剂进行洗脱,收集色素液,于波长450 nm处测定吸光度。
(1) 吸附剂的选择。分别称取15 g硅胶、硅藻土、氧化铝、硅胶∶硅藻土=1∶1吸附剂,湿法装柱,加入1 mL类胡萝卜素粗提液,用洗脱剂(石油醚∶丙酮=2∶1) 进行洗脱,收集色素液,于波长450 nm处测定吸光度。
(2)吸附剂质量的选择。分别称取10.0,15.0,17.5,20.0,25.0 g的硅胶,用洗脱剂(石油醚∶丙酮=2∶1) 湿法装柱,进行洗脱,收集色素液,于波长450 nm处测定吸光度。
(3) 洗脱剂的选择。称取5份15 g硅胶,分别用洗脱剂(石油醚∶丙酮=4∶1,10∶3,7∶3,2∶1,5∶3)湿法装柱,加入1 mL类胡萝卜素粗提液,洗脱,收集色素液,于波长450 nm处测定吸光度。
于波长450 nm下测粗提液的吸光度,根据β-胡萝卜素标准品绘制的标准曲线计算类胡萝卜素含量。Y=0.073 6X+0.002 7,Y为吸光度,X为质量浓度(μg/mL)。
采用1.3中最佳纯化条件下的分离色素液,用纯丙酮作对照,于波长300~700 nm处进行紫外光谱扫描分析。
料液比对红叶石楠类胡萝卜素提取效果的影响见图1,提取时间对红叶石楠类胡萝卜素提取效果的影响见图2,提取溶剂对红叶石楠类胡萝卜素提取效果的影响见图3,提取温度对红叶石楠类胡萝卜素提取效果的影响见图4。
从图1可知,在料液比1∶10时,类胡萝卜素总含量最高,提取效果最好。由图2可知,随着提取时间增加,类胡萝卜素含量提高,超过2 h后,类胡萝卜素含量逐渐减少。由图3可知,最佳提取溶剂为丙酮,此时类胡萝卜素含量达最大值,类胡萝卜素提取效果最佳。由图4可知,提取温度在40℃时,类胡萝卜素总含量最高,提取效果最好。
L9(34)提取正交试验结果见表2。
表2 L9(34)提取正交试验结果
由表2可知,各因素影响大小依次为料液比>提取温度>提取时间>提取溶剂,最优理论条件组合是A1B3C2D2,通过试验验证,此结果提取效果最佳,类胡萝卜素含量平均值为51.40 μg/g,但跟表2中最高提取组合A1B2C2D2中类胡萝卜素含量51.26 μg/g差距不大,考虑到经济效益,因此选择在40℃下以丙酮∶乙醇=1∶1为提取剂,料液比1∶10,浸提时间1.5 h为最佳提取方案。
吸附剂种类对类胡萝卜素含量的影响见图5,吸附剂质量对类胡萝卜素含量的影响见图6,洗脱剂种类对类胡萝卜素含量的影响见图7。
由图5可知,当吸附剂为硅胶时,类胡萝卜素含量达到最大值,分离纯化效果最佳。由图6可知,吸附剂硅胶质量为20 g时,分离纯化效果最好。由图7可知,当洗脱剂为石油醚∶丙酮=10∶3时,分离纯化效果最好。
由于硅胶外的其他吸附剂分离纯化效果不佳,因此不再进行正交试验获取最佳纯化方案,由吸附剂质量及洗脱剂种类试验,纯化倍数最高的方案是20 g硅胶作为吸附剂,石油醚∶丙酮=2∶1作为洗脱剂,测得样品类胡萝卜素质量浓度为7.22 μg/mL。此时纯化倍数=7.22/5.13=1.41,式中5.13和7.22分别为纯化前后样品中类胡萝卜素的质量浓度。
分离的类胡萝卜素吸收光谱图见图8,β-胡萝卜素吸收光谱图见图9。
由图8可知,红叶石楠绿叶中分离的类胡萝卜素具有类胡萝卜素的3个吸收峰的光谱特征,与图9进行对比,更能看出分离色素的最大吸收波长和精细结构与β-胡萝卜素较吻合[5]。
从红叶石楠绿叶中提取类胡萝卜素的最佳工艺条件为在40℃下以丙酮∶乙醇=1∶1为提取剂,料液比1∶10,浸提时间1.5 h,其类胡萝卜素提取率平均值可达51.26 μg/g,具有一定的可行性和应用前景,值得进一步探索研究。