线粒体融合蛋白参与调节女性生殖功能的研究进展

孔德琦，姚桂东，孙莹璞

(郑州大学第一附属医院生殖医学中心 郑州大学第一附属医院生殖与遗传专科医院，郑州 450052)

线粒体融合蛋白(mitofusin，Mfn)，又名增生抑制基因(hyperplaisa suppressor gene，Hsg)，是一类位于线粒体外膜的三磷酸鸟苷酶(GTPase)，共有Mfn1和Mfn2两种亚型。其中，Mfn1由位于3号染色体长臂2区6段(3q26.33)的MFN1基因编码，Mfn2编码基因则位于1号染色体短臂3区6段(1p36.22)。Mfn家族催化线粒体外膜的融合，与视神经萎缩蛋白1(optic atrophy 1，OPA1)、线粒体分裂蛋白1 (dynamin related protein 1，DRP1) 等共同参与调节线粒体的融合和分裂，进而影响线粒体的功能。Mfn N端的GTP酶结构域及与RAS结合的结构域，对于Mfn发挥特异性功能有重要意义[1]。Mfn高表达于神经、心肌等高耗能器官，主要通过调控线粒体能量产生、清除氧自由基、维持自噬及凋亡等方参与调节机体多种生理病理过程[2-3]。在生殖活动中，Mfn参与调控精子质量，弱精子症患者精子中Mfn2表达水平显著下降且精子解冻不存活风险大大增加[4]；同时Mfn表达于女性卵巢卵泡颗粒细胞及卵母细胞[5]，参与卵泡发育、卵子成熟及排卵等生殖过程。本文将重点综述Mfn在雌性哺乳动物生殖功能调控中的研究进展。

一、Mfn参与卵泡发育

卵泡是卵巢的基本功能单位。女性出生时，双侧卵巢内储存大量原始卵泡，进入青春期后，99%的原始卵泡发生闭锁，仅剩不到1%的原始卵泡。这些原始卵泡在体内成熟激素水平的刺激下，卵泡外侧颗粒细胞增殖分化，卵泡内初级卵母细胞减数分裂，直至成熟窦卵泡形成并排出卵子。在卵泡发育过程中，卵母细胞中线粒体不仅数量逐渐升高，同时形态和空间分布均发生改变，从而为卵母细胞减数分裂和染色体的分离奠定基础。此外卵泡颗粒细胞线粒体受损也极大程度影响卵泡发育潜能[6]。

1.Mfn促进窦前卵泡向窦卵泡转化：有研究通过特异性敲除小鼠卵母细胞Mfn1发现，小鼠生育能力丧失，窦卵泡的数目及GV期卵母细胞数目均显著下降，且无成熟卵细胞及受精后双原核形成；线粒体形态也出现了显著差异，线粒体体积增大、纵横比降低而且其ATP生成显著下降[7-8]。Machado等[9]近期的研究发现，小鼠卵母细胞特异性敲除Mfn1以及Mfn1和Mfn2双敲除后，小鼠均不育；然而Mfn2单敲除小鼠的生育能力并不受影响，说明在卵泡发育中Mfn1的作用是不可缺少的，而Mfn2对卵泡发育似乎无明显调控作用。与Zhang等[7]的研究结果一致的是，Mfn1特异性单敲除后，小鼠卵巢停滞在窦前卵泡状态，不仅窦前卵泡向窦卵泡转化受到影响，后续的排卵活动及黄体生成率均比正常对照组大幅度下降。这些结果表明Mfn1可能在后期窦前卵泡成熟阶段发挥重要的调控作用，而在卵泡发育早期，即原始卵泡激活以及初级卵泡发育过程中的调控作用并不明显。

2.Mfn参与卵母细胞-体细胞交互作用：Mfn家族参与卵泡发育的机制研究[7，9]，卵母细胞-体细胞交互作用受其影响较大。在窦前卵泡向窦卵泡转化过程中，颗粒细胞将根据部位和功能分化为两部分：内层的卵丘细胞紧紧包裹着内部的卵母细胞，且通过缝隙连接进行物质交换和代谢活动[10]；外层的壁颗粒细胞形成特化的上皮细胞，与基底膜一起位于卵泡外围包裹整个卵泡。除了缝隙连接，卵丘细胞胞浆内特化的突起可以穿过透明带，进而形成卵丘-卵母细胞复合体。除了该特化的组织结构外，卵母细胞旁分泌也参与交互作用。研究最广的旁分泌因子代表，是两个在氨基酸序列及空间三级结构都具有高度相似性的因子：生长分化因子9(GDF9)和骨形态发生蛋白15(BMP15)。

BMP15基因定位于X染色体上，GDF9基因定位于5号染色体长臂。除始基卵泡以外，各个卵泡阶段中GDF9和BMP15均有表达，其参与到卵泡发育、排卵活动和黄体生成过程中，直到卵细胞受精后[11-12]。尤其是在窦前卵泡向窦卵泡转化中，一方面卵母细胞高表达GDF9和BMP15，调节颗粒细胞糖脂代谢并促进其合成丙酮酸、乳酸及胆固醇等，进而通过缝隙连接为卵母细胞提供营养[11，13]；另一方面，颗粒细胞高表达GDF9和BMP15直接作用于自身，促进颗粒细胞的增殖分化并参与卵泡刺激素介导的卵泡发育[14-15]。小鼠卵巢Mfn1和Mfn2双敲除后[7，9]，卵巢GDF9、BMP15表达水平均显著下降；除此之外，特异性敲除Mfn1后，GDF9表达水平下调，而BMP15表达水平不变。综上，Mfn1及Mfn2可能参与调节肿瘤坏死因子(TNF)β家族介导的卵母细胞-体细胞交互作用，进而促进颗粒细胞增殖分化及卵泡的发育。

有文献报道，使用慢病毒感染小鼠卵巢过表达Mfn2后，随着作用时间的延长，小鼠卵巢内卵泡逐渐发育，血中雌孕激素及卵巢内雌孕激素受体的表达水平均发生显著升高；而下丘脑-垂体来源的黄体生成素与卵泡刺激素表达无明显变化[16]。表明Mfn2可能从卵巢水平，而非下丘脑-垂体水平参与卵泡发育调控。

Mfn促进窦前卵泡向窦卵泡转化、参与卵母细胞-体细胞交互作用并调控卵泡中颗粒细胞激素分泌，在卵泡发育中发挥重要作用。此外，Mfn参与某些化学物质的卵巢致毒机制，如氟化物可通过促进颗粒细胞中Mfn1表达，增加氧自由基损伤并破坏线粒体氧化呼吸链从而降低其ATP生成，抑制卵泡发育[6]。

二、Mfn参与卵母细胞成熟

卵母细胞成熟主要是指卵母细胞由生发泡期(GV期)发育至减数第二次分裂中期(MⅡ期)。Mfn1和Mfn2通过调控线粒体形态结构及空间位置，调节线粒体功能，参与纺锤体形成及同源染色体分离等参与卵子成熟。

1.参与线粒体空间位置及形态结构改变：有研究在多种哺乳动物的卵母细胞体外成熟(IVM)过程中观察到，GV期的线粒体主要分散环绕于透明带周围，发育至MⅡ期时线粒体逐渐向中心迁移[17]。卵母细胞过表达Mfn1和Mfn2可以促进MⅡ中线粒体环绕纺锤体；而且过表达Mfn1和Mfn2后使用微管解聚诱导剂Nocodazole发现线粒体的集聚消失而分布重新变分散，证明Mfn家族可能通过微管调节线粒体时空分布；然而使Mfn1 GTPase结构域(Mfn1k88t和Mfn1t109a)突变后，线粒体核周聚集现象消失，证明Mfn通过发挥其酶催化作用改变线粒体形态及分布[18]，但是具体功能不详，有待进一步研究。

Liu等[19]发现GV期降调Mfn2抑制MⅡ期线粒体集聚，使线粒体分散于细胞质中；而Zhang等[20]研究发现GV期降调Mfn2能促进线粒体紧密环绕于纺锤体周围。此外，使用三维延时成像技术可以观察到GV期过表达Mfn1和Mfn2后，随着卵子成熟，内质网集聚于线粒体所在部位，而且线粒体外膜与内质网交联，降低内质网钙离子储存量，影响胞内钙离子稳态。

2.参与调节线粒体功能及纺锤体形成：Liu 等[19]发现降调GV期Mfn2后，使用JC-1染色检测MⅡ期卵母细胞中线粒体膜电位示，膜电位下降且MtDNA表达量明显下降。而Dai等[21]发现GV期过表达Mfn1和Mfn2后，MⅡ期卵母细胞的ATP含量并没有显著升高。使用开放式麦管(OPS)对猪的卵子进行玻璃化冷冻，发现Mfn2表达量明显降低，凋亡通路被激活而且活性氧产生增加。由此可见，卵子成熟过程与Mfn2密切相关，Mfn2通过抑制内源性凋亡，促进ATP产生、清除氧自由基等方式调节卵母细胞成熟。

有研究发现，GV期过表达Mfn2及过表达Mfn1均会抑制纺锤体形成，抑制同源染色体分离[18-20]。但Mfn如何精细调节这一减数分裂过程，具体机制尚未研究清楚。

Mfn在卵母细胞中的精细表达与卵子成熟密切相关，目前该领域仍有很大研究空间，例如Mfn如何调节卵母细胞中的钙离子稳态，如何维持卵子发育不同时期所需的线粒体形态，如何调节同源染色体的分离等。阐明这些具体机制对于探究卵母细胞细胞质成熟及遗传学中染色体数目异常的形成机制具有重要意义。

三、Mfn参与生殖系统疾病病理发生

1.参与多囊卵巢综合征(PCOS)的病理机制：通过外显子测序发现，Mfn2可作为“上半身对称性脂肪过多伴下肢脂肪代谢障碍伴神经病变”的候选基因[22]，Mfn2突变后脂肪组织形态正常，而瘦素表达量下降[23]。高脂饮食的大鼠Mfn2表达降低，削弱了肝脏对胰岛素的反应性[24-25]，而过表达Mfn2可改善这一点[26]。Mfn2表达水平也与骨骼肌的胰岛素敏感性之间存在正相关[27]。由此可见，Mfn2参与维护多个组织器官的胰岛素敏感性，并可能参与调节PCOS患者的胰岛素抵抗。此外大鼠PCOS模型中Mfn2与PI3K-AKT-mTOR通路存在同向低表达现象[28]，暗示PCOS中的卵泡发育障碍可能与Mfn低表达相关。

2.参与维持卵巢储备功能：Wang等[5]发现卵巢储备功能低下(DOR)患者卵泡颗粒细胞中Mfn2表达量明显低于正常组。通过对小鼠腹腔注射顺铂构建卵巢早衰(POF)模型后发现，卵巢储备功能衰竭病理机制可能与颗粒细胞中Mfn2低表达抑制能量产生并激活凋亡通路有关[29]。此外有研究发现POF小鼠模型中miR-125a明显上调并通过抑制转录激活因子3(STAT3)促进凋亡发生[30]；而胰腺癌细胞中miR-125a可通过mfn2抑制线粒体分裂[31]。故在参与维持卵巢储备功能过程中，Mfn可能与miR-125a密切相关。

四、Mfn参与维护妊娠期子宫内环境稳态

绒毛滋养层根据形态学及功能可以分为两个部分：细胞滋养层和合体滋养层，其中合体滋养层可实现胎盘对营养物质、代谢产物、免疫相关因子等的转运。Mfn2广泛分布于细胞滋养层与合体滋养层的细胞质中，而在细胞核及绒毛间质细胞中则无表达。Chen等[32]发现Mfn1缺陷不影响小鼠胎盘生成，而Mfn2缺陷导致小鼠胎盘发育不良，其中滋养层巨细胞数目大幅降低，提示Mfn2可能通过调节滋养层巨细胞数目参与胎盘发育。此外，早期胚胎停育的患者绒毛组织中Mfn2低表达，线粒体结构功能均受损，表现为线粒体膜破裂、线粒体嵴排列混乱、ATP生成降低、线粒体自噬受到抑制而凋亡通路激活等[33]。Cai等[34]研究发现在人滋养层细胞中降调Mfn2后，LC3、BECLIN1、ATG5等自噬相关蛋白表达均下降，证明Mfn2通过促进细胞自噬，维持妊娠早期HCG水平及滋养层细胞正常功能。先兆子痫患者的胎盘中Mfn2表达水平明显低于对照组[35]，同时血清中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)这一DNA损伤标志物随着胎盘滋养层细胞Mfn2表达水平降低而升高，提示Mfn2抑制线粒体中氧化自由基的清除及能量生成，继而参与先兆子痫发生发展的病理机制中[36]。也有研究表明，先兆子痫患者血清中Mfn2水平明显高于正常组[37]，提示Mfn2在作为先兆子痫分子标志物方面具有一定潜能。此外还有研究发现，妊娠期糖尿病患者的胎盘中Mfn2表达量也较低，但其具体机制尚不详[38]。

五、结语

综上，Mfn家族作为促进线粒体外膜融合的蛋白酶类，调节线粒体相关功能，与卵泡发育、卵子成熟、生殖系统相关疾病和妊娠期子宫内环境稳态都有密切的联系。由此可以推测Mfn对于女性生殖系统发育和调控具有重要意义。现阶段关于Mfn的研究主要集中于卵子成熟过程中Mfn对减数分裂纺锤体及同源染色体分离的影响；关于Mfn1及Mfn2在窦前卵泡向窦卵泡转化过程中的替代关系也值得进一步探索；但现有的关于Mfn的研究尚未阐明其在妊娠期胎盘中的具体调控机制，从该方面入手研究Mfn对滋养层细胞功能的影响，可以促进对妊娠期相关疾病如先兆子痫、妊娠期糖尿病等诊治的完善。研究Mfn对女性生殖系统的调控作用，可以为女性不孕不育提供一个新的病因学思路，为辅助生殖技术的发展奠定一定的理论基础，继而促进女性生殖健康。