非标记表面增强拉曼光谱在病原菌检测中的应用

李佳，沈瀚，顾兵

1.南京大学医学院 附属鼓楼医院检验科，江苏 南京 210008；2.徐州医科大学 附属医院检验科，江苏 徐州 221002；3.徐州医科大学 医学技术学院，徐州市实验诊断学重点实验室，江苏 徐州 221002

据统计每年大约有超过3亿例由细菌感染引起的致命性疾病，造成200多万人丧失生命[1]。如果细菌感染可以在早期阶段得到有效治疗，那么存活率可以大大提高[2]。因此，临床上迫切需要快速、灵敏和成本较低的检测致病菌的技术。目前，我国临床微生物实验室对病原菌的检测仍依赖传统的培养方法，包括在选择性培养基中培养、对细菌菌落进行形态分析，以及进行细菌代谢物的测定，一般需要3～5 d才能出报告，耗时耗力[3]。近年来随着生物技术的快速发展，基因芯片、质谱技术以及二代测序技术作为传统检测方法的补充，在病原菌的鉴定与药敏试验中得到了一些探索与应用，但仍存在不少问题，离临床应用距离较远。基因芯片技术虽然具有高通量、快速和自动化的优势，但仪器设备成本昂贵而难以用于临床[4]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是目前逐步用于临床微生物快速鉴定的革命性技术，遗憾的是该技术不能用于病原菌的药敏检测，且仪器价格昂贵在一定程度上限制了该技术的应用[5]。二代测序技术也是目前细菌鉴定和耐药性分析的有力工具，但成本较高，且目前生物信息学人才缺乏，面对海量信息的测序结果，难以短时间内得到正确可靠的分析结果，限制了测序技术在临床的推广[5-6]。因此，非常需要研发一种速度快、灵敏度高、特异性强的临床病原菌检测方法[7]。

表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）具有灵敏度高、检测速度快、成本较低和方便携带等很多优点[8-9]，从而在化学和生物领域中得到广泛应用[10-13]。早在1989年，Holt和Cotton就首次对细菌的SERS图谱进行了报道[14]。4年之后，Magee教授又提出利用整个生物体的指纹谱图谱对病原菌进行检测是完全有可能实现的[15]。此后，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌、枯草杆菌、蜡样芽孢杆菌及伤寒沙门菌等细菌的指纹谱及基于SERS检测细菌的新方法被相继报道[16-19]。可见，SERS为病原菌的快速检测打开了新的大门。菌体表面成分复杂，含有多种生物大分子如蛋白质、脂类、多糖等，普通的分析方法很难对其进行实时、原位及无损检测。SERS的高灵敏及指纹谱等特点可以满足病原微生物检测快速、准确的要求。

1 SERS的基本理论

1928年，印度科学家拉曼（Raman）首次发现了拉曼散射现象，其携带的分子结构信息，能直观地为分子的振动、化学键、基团的研究提供检测手段，因此是一种表征分子结构振动的非弹性散射光谱。然而，信号弱这一缺点限制了拉曼光谱的实际应用。直到1974年，Fleischmann等发现吸附在粗糙银电极表面的吡啶分子的拉曼信号得到极大提高，这个现象称为SERS[20]。与其他光谱检测方法相比，SERS具有如下明显优势：SERS提供物质分子独特的指纹谱信息以实现未知物的定性定量检测；SERS检测灵敏度很高，理想情况下SERS增强因子可达到1010～1014，可以实现单分子检测[21-22]；SERS谱带较窄，谱峰分辨率高，可以有效避免荧光背景干扰，适用于多组分同时探测；SERS检测对样品要求低，固相、液相和气相的样品都可以检测。

SERS的增强主要有2个机制，即电磁增强和化学增强[23]。普遍认为远程电磁增强和短程化学增强效应对放大拉曼信号同时起作用[24]。通常，电磁增强的增强因子被认为是106～108的量级，而化学增强的增强因子只能是102量级。化学增强，即分子在贵金属粗糙表面的某些位点被吸收，来自分子的电子与来自金属表面的电子相互作用，产生与共振拉曼散射类似的增强效应[25]。由于增强底物、吸附分子和相互吸附位点不同，化学增强产生的SERS增强效果也不同[26]。与化学增强相比，由局域表面等离子体共振的激发引起的电磁机制增强被认为是产生SERS现象的主要原因[27]。传导电子的振荡可以发生在贵金属纳米颗粒、尖锐的金属尖端或粗糙的金属表面，在这个过程中，它可以导致局部电磁场的重新分布，使得贵金属纳米颗粒周围特定位置的电磁场的大幅增强[28]。这种增强具有很强的距离依赖性，距离的微小减小可以导致强度的显著提高，只有分子非常接近金属表面才可以产生巨大的场强。因此，SERS检测成功的关键是使待测物质与SERS底物表面尽量接触尽可能多的点。

2 非标记SERS法用于病原菌检测

非标记SERS方法具有较高的灵敏度和丰富的光谱特征，这些特点为细菌检测提供了新的研究方向[29]。现有研究缺乏SERS谱带归属的汇总或相应的数据库，因此，大多数基于非标记SERS的研究重点是解释细菌的SERS并进行SERS检测病原菌新方法的探索。

Jarvis等通过体内还原靠近细胞内膜的细胞质内的Au（Ⅲ），首次报道了来自细菌内部结构的SERS信号[30]。在拉曼位移为1250 cm-1处的SERS峰的产生与细胞膜和胞质蛋白相关。我们发现SERS峰主要来源于细菌细胞壁的成分，如核酸、蛋白质、多糖、碳水化合物和脂质以及复杂的分子聚合物[31]，SERS增强机制中的距离依赖性也支持这一假说。拉曼位移在 624、652、735、955、1330和1456 cm-1处的SERS谱峰主要来自细胞壁。拉曼位移在735和1330 cm-1处的SERS谱峰是腺嘌呤或单磷酸腺苷的典型特征[32]，可以更准确地归属于腺嘌呤的平面环状呼吸模式或来自其他含腺嘌呤分子（FAD、NAD等）以及嘌呤部分的不同产物[33]。拉曼位移为735和1130 cm-1处的峰归属于变性DNA，这也证明了Ag纳米球（Ag NSs）和细菌细胞壁之间结合紧密。所有细菌在给定的光谱区域520和1050 cm-1中有相似的峰，其中某些峰的强度存在一些差异。细菌的SERS提供了分子结构、细胞成分和生理状态特征，可用于区分不同菌种或区分活细菌和死细菌[34-35]。例如，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在拉曼位移1128～1388 cm-1范围内，可以看出SERS的明显差异。来源于蛋白质CH变形的拉曼位移为1330 cm-1处的SERS峰强度表明革兰阴性菌的细胞壁含有比革兰阳性菌更多的蛋白质[36]。用SERS比较死细菌和活细菌时，SERS的不同可能是由于死细菌细胞壁外膜的破裂所致[37]。

主要用于细菌检测的非标记SERS方法是通过将贵金属纳米颗粒和溶液中细菌混合或者通过在细菌附着的增强基底上形成一层纳米粒子薄膜。只有当基底具有可重复性并且能提供高度增强SERS信号时，才能成功检测细菌。

Wang等发明了一种新型单分散Ag NSs的SERS基底，其具有由Ag纳米晶体（Ag NCs）组装形成的热点，用于区分3种病原菌（大肠杆菌O157、伤寒沙门菌和金黄色葡萄球菌）以及区分活细菌和死细菌[38]。由Xu等发明的准三维等离子体纳米结构阵列构成的SERS基底，可用于快速检测7种临床上和环境中常见的副溶血性弧菌菌株。上述2项研究均成功地鉴定了病原菌，但没有理想的定量结果[39]。

万古霉素是一种抗生素，可以通过细菌细胞壁上的肽聚糖和万古霉素的羰基和胺基之间形成氢键，紧密结合细菌，增加细菌对纳米金属表面的黏附可以使检测限大大提高[40]。万古霉素可以将一小部分细胞壁与SERS基底之间距离拉近，形成热点，从而导致SERS信号大大增强[41]。万古霉素修饰的Ag NRs可以更容易地捕获革兰阳性细菌[42]，研究发现万古霉素包被的Ag-Au基底对革兰阴性和革兰阳性菌的SERS增强效果比没有被万古霉素或头孢他啶水合物包被的基底增强效果更好，还可以排除血液成分的干扰[43]。虽然基于纳米金属表面的SERS增强方法可以提供病原菌相对稳定和可重现的SERS信号，但复杂的合成和较高的成本限制了其应用。

与上述纳米金属表面相比，贵金属纳米颗粒更容易合成，因此应用更加广泛。通常使用胶体金、胶体银与细菌简单混合进行非标记SERS检测[44]，但所产生的混合物可能会导致纳米颗粒在病原菌表面随机分布，使得SRES的重现性差。由于革兰阴性和革兰阳性菌的细胞壁分别存在脂多糖或磷壁酸而带负电，因而可以通过静电吸引力使纳米颗粒沉积在细菌细胞壁上。例如，Kahraman等报道了聚丙烯氯化铵（PAH）/Au NPs/PAH逐层结构，其可以通过静电相互作用高效且精确地沉积在细菌细胞壁上，用于单个细菌的SERS检测[45]，但这一方法步骤复杂且无法实现定量。原位合成法可以保证纳米颗粒与细菌细胞壁的均匀接触。Zhou等提出通过静电作用在细菌细胞壁上原位合成Ag NPs，从而更好地对饮用水中的细菌进行SERS检测[46]。使用这种方法增强细菌的拉曼信号比胶体和细菌简单混合的悬浮液得到的SERS信号要强很多[47]，此方法对水中病原菌细胞的最低检测限为2.5×102/mL。此外，我们发现Ag NPs合成后细菌的拉曼信号强度主要取决于细胞壁的Zeta电位。此外，我们研究了这种方法用于区分野生型菌株和抗生素耐药突变菌株的机制，以及通过SERS图谱对活细菌和死细菌进行计数[48]，结果表明电荷似乎只与细菌表面Ag NPs的重新合成有关，而与它们的持续附着无关。这一方法具有许多优点，例如操作简单、反应物体积较小、灵敏度和选择性高，以及良好的重现性，可以应用到更复杂的样品如食品或血液样品中。

尽管目前通过SERS增强基底直接增强纯培养的细菌来获得目标菌的SERS指纹图谱并进行聚类分析的方法有很多报道，但直接对临床样本中的病原菌进行快速SERS检测的研究仍有很多困难。临床样本组成较为复杂，而普通SERS增强基底缺乏选择性，实际样本中的杂质信号会严重干扰目标细菌的SERS信号。针对这一难点，研究人员提出了一种利用广谱生物识别分子修饰的SERS基底，从复杂样本中分离、纯化细菌后，直接检测其SERS指纹谱信号的新方法。如2011年，王玉麟等报道了万古霉素修饰的固态纳米银基底可以从血液中捕获多种病原菌[49]。2014年，何耀等利用巯基苯硼酸修饰的硅基银基底在血液中直接捕获并检测了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌[50]。2016年，王升启等报道了一种利用聚乙烯亚胺修饰的金壳磁珠能够快速捕获、富集并直接增强出病原菌的拉曼信号，用该方法在牛奶等复杂溶液中检测细菌只需15 min，检测限为1000 CFU/mL[51]。上述基于修饰的SERS基底指纹谱检测病原菌的方法具有快速检测实际样本中病原菌的潜力，但检测灵敏度还较差（＞500 CFU/mL），并且无法区分混合菌群。

3 结语

以上我们总结了近年来非标记表面增强拉曼光谱检测病原菌的进展。大量研究表明，通过合理构建基于非标记的SERS检测体系，将SERS技术与其他技术结合，即具有实现快速检测病原菌的强大潜力。然而非标记SERS检测病原菌仍存在很多问题。例如，纳米材料的增强作用在不同位点是不同的，粒子之间距离越近，偶合和增强效应就越强，反之增强效应就越弱，因此，SERS技术应用的关键在于制备出均匀、稳定和可重现性好的增强基底；SERS直接检测在复杂体系中极易受到干扰信息的影响，因此，提高检测方法的选择性，是SERS技术应用于实际复杂检测体系的关键；所获SERS图谱的分析目前还做不到一键式，需要后期处理；科研人员还须构建标准化操作程序，使SERS成为检测病原菌的常规项目，并建立相应的病原菌数据库以实现病原菌快速鉴定。