纳米硒的制备及生物医学应用研究进展

苏华华，王艳华

三峡大学 医学院，湖北 宜昌 443002

硒最早于1817年由瑞典化学家Berzelius从硫酸厂的铅室底部的红粉色物质中制得，并把它命名为硒[1]。硒是生物体不可缺少的微量元素。硒的营养功能是通过25个含有硒代半胱氨酸活动中心的硒蛋白来实现的。流行病学、生物学和临床研究表明，硒缺乏会导致各种疾病的发生，例如甲状腺功能障碍、糖尿病、心血管疾病、认知功能低下和癌症[2]。膳食补充中最常用的硒形式是有机硒（硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸）和无机硒（硒酸盐、亚硒酸盐），但它们在功能性和毒性之间非常窄的浓度阈值限制了其在临床疾病防治中的广泛应用[3-4]。因此，毒性检测一直是开发硒基抗癌药物的关键问题[5]。许多研究表明，与有机或无机硒化合物相比，纳米硒的毒性更小，生物利用度更高，具有更强的生物活性，在生物医学领域具有广阔的应用前景[6-7]。纳米硒可以通过物理法、化学法和生物法合成。本文将对纳米硒的制备以及生物医学应用进展进行简要综述。

1 纳米硒的制备

1.1 物理合成法

纳米硒可以通过辐射法和激光烧蚀法进行合成。El-Batal等[8]采用γ线辐照辅助的方法获得纳米硒。Guisbiers等[9]通过脉冲激光烧蚀浸没在去离子水中的纯硒丸，得到粒径为115±38 nm的纳米硒颗粒，纳米硒的大小可以通过激光参数（如波长和脉冲持续时间）等来控制且不易受到化学试剂的污染。但物理法一般需要高温、高压、催化剂等技术，低效率、低产量和昂贵的仪器设备使其并未广泛用于纳米硒的生产中。

1.2 化学合成法

化学方法制备纳米硒通常是用抗坏血酸还原亚硒酸钠溶液，但此方法获得的纳米硒颗粒易团聚，因此，加入分散剂或稳定剂来使纳米硒维持稳定为制备纳米硒材料提供了极好的途径。Xiao等[10]使用冬虫夏草胞外多糖（EPS）作为稳定剂，在亚硒酸钠和抗坏血酸的氧化还原体系中合成了单分散的纳米硒（EPS-SeNPs），EPS-SeNPs表面多糖羟基的物理吸附作用增强了纳米硒的稳定性。Xia等[11]首次以甲醛次硫酸氢钠（SFS）为还原剂，在50℃下连续搅拌4 h制备得高纯度三角硒（t-Se）纳米线，其粒径为100～200 nm，长度则可达10 μm。Zhang等[12]以β乳球蛋白（Blg）作为稳定剂制备了粒径为36.8±4.1 nm的球形纳米硒（Blg-SeNPs）。傅里叶红外光谱（FTIR）检测结果表明，β乳球蛋白分子上的功能性基团（即-NH2和-OH）和疏水域可以与纳米硒结合形成稳定的纳米系统。Blg-SeNPs在4℃的酸性或中性至碱性溶液（pH2.5～3.5或6.5～8.5）中稳定长达30 d。

1.3 生物合成法

利用植物提取物、真菌、细菌合成生物源性纳米硒颗粒已被广泛报道。植物和微生物中的生物分子在纳米颗粒合成过程中发挥着还原和稳定的双重作用。Fesharaki等[13]将含纳米硒颗粒的肺炎克雷伯菌培养液于121℃灭菌20 min，释放出粒径为245 nm的纳米硒粒子。在湿热灭菌过程中，纳米硒粒子没有发生化学变化，说明微生物合成的纳米硒结构稳定，可以耐高温、高压。Xu[14]等报道了干酪乳杆菌ATCC393在厌氧条件下将有毒的亚硒酸钠转化为红色元素硒来产生纳米硒，以粒径50～80 nm在细胞内积累。此外，与亚硒酸钠和硒代蛋氨酸相比，被生物蛋白-多糖封端的纳米硒具有更低的细胞毒性。Vetchinkina等[15]首次采用药用担子菌香菇菌株F-249还原有机硒和无机硒化合物来制备生物纳米硒。通过透射电子显微镜（TEM），电子能量损失谱（EELS）和X线荧光显示，被还原的硒以粒径为180.51±16.82 nm的球形纳米颗粒的形式在菌丝细胞内积累。Ahmad等[16]用酵母提取物转化硒的有毒氧阴离子，在细胞内合成粒径为50～250 nm的球形纳米硒颗粒。Chen等[17]研究发现，从海藻裙带菜中提取的多糖可以增强纳米硒的稳定性，所形成的单分散球形纳米硒在多糖溶液中可以保持稳定至3个月。Mellinas等[18]以可可豆壳提取物作为稳定剂和还原剂，通过微波加热成功合成了粒径为1～3 nm的纳米硒，所获得的纳米硒在4℃下可稳定55 d。

2 纳米硒在生物医学中的应用

2.1 抗氧化作用

纳米硒比其他化学形式的硒具有更好的抗氧化能力，是一种高效的抗氧化剂，可通过清除自由基、激活抗氧化硒酶的活性、增强抗氧化防御体系等多种方式发挥抗氧化作用。Xiao等[10]研究发现合成的生物纳米硒具有很强的抗氧化活性，对2，2-联氮-二-3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸二铵盐自由基阳离子（ABTS+）和超氧阴离子自由基具有明显的清除能力，并且在Se/P比例为1∶1时合成最小尺寸为80 nm，清除自由基的能力最强。Chen等[19]使用壳聚糖（CS）作为还原剂和稳定剂合成了83～208 nm的CS-Se纳米复合材料。研究发现，CS-Se纳米复合材料能直接清除1，1-二苯基-2-三硝基苯自由基（DPPH）、ABTS+自由基和羟基自由基；此外，纳米粒子的大小对自由基的清除活性有着显著影响，在体外不同尺寸大小的CS-Se纳米复合材料清除自由基的能力随尺寸的增加而减小，揭示纳米硒颗粒的大小在其生物学活性中起重要作用。Gunti等[20]报道合成的生物纳米硒表现出剂量依赖性的自由基清除活性，并且与亚硒酸钠相比，生物纳米硒对小鼠脑神经瘤细胞具有更好的生物相容性和低毒性。Bai等[21]研究发现，给小鼠口服负载纳米硒颗粒的壳聚糖微球，可以减少脂质过氧化并增强小鼠血清和肝脏中的谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性来抑制酒精诱导的氧化应激。Guo等[22]合成牛血清白蛋白（BSA）稳定的纳米硒，通过调节胆固醇代谢，增加抗氧化硒酶或硒蛋白的表达，显著减轻小鼠的高脂血症和血管损伤，在预防动脉粥样硬化中具有潜在的价值。

2.2 抗菌和抗病毒作用

近年来，纳米硒在抗菌方面的应用被广泛研究。纳米硒作为广谱抗菌剂具有巨大潜力，对病原细菌、真菌和寄生虫具有重要的抗菌活性。医疗器械上的微生物定植和生物膜的形成是引起医院感染的普遍问题。这不仅影响危重病人和免疫功能受损的患者，同时也会导致设备的故障。Sonkusre等[23]报道，利用地衣芽孢杆菌合成的生物纳米硒能抑制金黄色葡萄球菌在不同表面（聚苯乙烯、玻璃和导管）的黏附、生物膜和微菌落的形成。这些研究结果对于作为抗金黄色葡萄球菌假体的抗菌涂层和其他院内感染的医疗器械具有潜在应用价值。Guisbiers等[24]报道纳米硒颗粒很容易黏附在生物膜上，然后渗透到病原体中被硫取代，使细胞结构被破坏，从而抑制白色念珠菌生物膜的形成。Joshi等[25]研究发现合成的生物纳米硒对稻瘟病菌表现出优异的体外抗真菌活性，分别以50和100 ppm的浓度抑制辣椒和番茄叶片上的辣椒炭疽菌和链格孢菌的感染，并具有聚集和结合致病假单胞菌的游动孢子的独特性质。这揭示了纳米硒针对不同植物病原体的广谱抗真菌活性，从而以一种生态友好的方式管理植物病。Yazhiniprabha等[26]研究了用调料九里香（Murraya koenigii，Mk）提取物合成的球形纳米硒（Mk-SeNps）的抑菌和杀幼虫功效。结果显示，Mk-SeNPs对引起登革热的埃及伊蚊的第4龄幼虫具有显著的杀幼虫活性，并且可有效抑制革兰阳性菌（变形链球菌和粪肠球菌）和革兰阴性菌（铜绿假单胞菌和痢疾志贺菌）的生长。

纳米硒还显示出良好的抗病毒作用。Li等[27]合成了奥司他韦（OTV）表面修饰的纳米硒（Se@OTV），具有良好的抗病毒性和耐药性。虽然OTV本身作为一种有效的抗病毒药物在临床上的应用通常受到耐药病毒的限制，但Se@OTV对H1N1流感病毒有明显的抑制作用。Se@OTV通过抑制流感病毒糖蛋白血凝素和神经氨酸酶的活性来干扰H1N1感染宿主细胞。被修饰的纳米硒能够阻止H1N1感染犬肾细胞，阻断染色质凝聚和DNA断裂。此外，Se@OTV还抑制了活性氧的产生以及p53磷酸化和Akt的激活。因此，ROS在抗病毒作用中起关键作用。H1N1病毒的存在使细胞内ROS的产生从100%（对照）增加到380%，OTV和SeNPs略微抑制了ROS的产生，分别为270%和210%，而Se@OTV显著降低了ROS的产生（120%）。由此可见，Se@OTV可作为一种高效抗病毒药物，用于治疗由甲型流感病毒H1N1引起的高度传染性呼吸道疾病。

2.3 抗癌作用

纳米硒因具有高生物利用度、低细胞毒性、强抗癌活性等特点，近年来成为一种很有前途的抗癌药物。而其中诱导和促进癌细胞凋亡是它发挥抗癌作用的重要分子生物学机制。Cui等[28]将阿魏酸（ferulic acid，FA）修饰在纳米硒表面合成FA-SeNPs，在人肝癌HepG2细胞中具有明显的抗增殖作用。FA-SeNPs以剂量依赖性方式增加上游caspase-9和下游caspase-3的蛋白质水平，通过线粒体途径诱导HepG-2细胞凋亡。Zeng等[29]制备了蘑菇多糖修饰的具有高稳定性的球形纳米硒颗粒，通过诱导胱天蛋白酶和线粒体介导的内在凋亡途径在体内起抗肿瘤作用，但对正常器官没有明显毒性。Gao等[30]在体外实验研究中发现，猪苓多糖（PUP）稳定的纳米硒（PUP-SeNPs）对人乳腺癌细胞MDA-MB-231表现出增强的细胞毒性和抗增殖活性，并通过内在和外在途径参与诱导细胞凋亡。PUP-SENPSe可以裂解聚ADP核糖聚合酶（PARP），激活caspase-9、caspase-8和caspase-3，并通过线粒体介导的凋亡途径诱导MDA-MB-231细胞凋亡。因此，PUP-SeNP可作为膳食补充剂用于乳腺癌的化学预防。

2.4 药物载体

化学疗法是一种常用的癌症治疗策略，但会破坏正常组织而引起严重的副作用[31]。因此，近年来，靶向药物递送系统在癌症治疗中受到极大的关注。利用其功能的多样性和受体结合的特异性，多种含硒纳米载体（如加载基因、抗体、药物、生长因子等）被设计并合成，使其在抗癌治疗中显示出巨大潜力。功能化的纳米硒作为靶向药物递送系统可以增强细胞摄取和抗癌功效，在癌症治疗中具有重要作用。Zou等[32]使用透明质酸（HA）修饰的纳米硒装载紫杉醇（PTX）制备了HA-Se@PTX。HA-Se@PTX能够通过网格蛋白介导的内吞作用被癌细胞摄取，并通过激活caspase-3凋亡相关的信号通路来诱导凋亡，而不会对肿瘤小鼠的主要器官造成严重损伤，在非小细胞肺癌治疗中具有巨大潜力。Yang等[33]研究了叶 酸（folic acid，FA）修 饰 的 纳 米 硒 颗 粒（FA@SeNPs）协同增强放射性125I粒子的抗癌功效。研究表明，与X线相比，125I粒子表现出与FA@SeNPs具有更高的协同作用，通过活性氧的过量产生诱导DNA损伤并激活p53和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）凋亡信号通路，触发MCF-7癌细胞凋亡和G2/M细胞周期阻滞。这种联合治疗可改善抗癌药物的细胞靶向性并表现出放射增敏活性，显示了更好的体内抗肿瘤活性和更低的全身毒性，可用于癌症治疗。Fu等[34]报道了精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（RGD）肽修饰的、负载阿霉素（DOX）的纳米硒（RGD-NPs）。研究表明，与裸露的纳米硒和DOX相比，RGD-NPs通过整合素受体介导的内吞作用进入人脐血管内皮细胞（HUVEC），然后在溶酶体中积累，以时间和剂量依赖的方式抑制HUVEC的增殖。功能化的纳米硒在酸性刺激下膨胀成雪花状结构，可以延长药物的释放时间。进一步研究结果显示，RGD-NPS通过诱导活性氧介导的DNA损伤，抑制VEGFVEGFR2-ERK/AKT信号通路，使HUVEC凋亡和S期细胞周期阻滞，从而抑制裸鼠肿瘤生长和血管生成。为了探索纳米硒传递基因的可行性，Xia等[35]制备了以纳米硒作为肿瘤靶向基因载体，负载小干扰RNA（siRNA）的功能化的纳米硒用于人宫颈癌的治疗。功能化的纳米硒具有更高的体内抗肿瘤活性，在癌细胞微环境中显示出更快的siRNA释放，通过活性氧介导的线粒体功能障碍诱导宫颈癌细胞凋亡。

3 结语

综上所述，纳米硒在生物医学方面具有较大的应用潜力。随着制备工艺的进步，利用生物合成纳米硒，不仅可提高它的分散性能，而且还可增强其生物活性（抗氧化、抗菌、抗病毒、抗癌等），是当前合成纳米硒颗粒的最佳选择。材料-细胞相互作用也提示，生物合成的纳米硒颗粒对正常细胞低毒而对肿瘤细胞选择性杀伤，这些特征有益于未来将其作为抗癌治疗剂使用。然而当前的研究仅仅呈现了它们的生物作用，对其生物作用的机理，尤其是抗癌作用的分子机制尚知之甚少。且在人体复杂的生理病理环境中，这些纳米硒是否具有毒性，是否能参与激活免疫细胞、神经细胞、内分泌细胞，又是如何发挥作用的，这些问题仍有待于继续深入研究。相信随着科学技术的不断发展和研究工作的不断深入，纳米硒材料在抗菌、抗氧化、抗癌、药物载体等领域将取得越来越广阔的应用。