铜绿假单胞菌外毒素A蛋白疫苗的研制现状

李文桂，陈雅棠

重庆医科大学附属第一医院 传染病寄生虫病研究所，重庆 400016

铜绿假单胞菌（Psendomonas aeruginosa）是一种院内感染的常见致病菌，用抗生素治疗易产生耐药性，需要探索其他治疗方法。许多研究表明脂多糖、多糖、藻酸盐、鞭毛或菌毛均可作为疫苗使用，但有许多缺陷，故需寻找其他抗原[1]。铜绿假单胞菌外毒素A（P.aeruginosaexotoxin A，PEA）编码基因长约1.9 kb，编码的蛋白相对分子质量（Mr）为66 000，由613个氨基酸残基组成。研究表明，PEA含有252个氨基酸残基的结构域Ⅰa、128个残基的结构域Ⅱ、39个残基的结构域Ⅰb以及194个残基的结构域Ⅲ。PEA具有下述作用：呈现ADP-核糖基转移酶的活性，既有较强的免疫原性，又有较好的佐剂效应，可作为黏膜佐剂使用；催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）水解为烟酰胺（N）和腺苷二磷酸核糖（ADPR），ADPR结合EF-2后使其失活，导致肽链无法延长，从而阻止蛋白的合成[2]；抑制淋巴细胞的转化，抑制外周血单核细胞（PBMC）产生TNF-α、IL-6、IL-10和IL-8等细胞因子[3-5]；诱导中性粒细胞、肥大细胞和鼠胚胎成纤维细胞发生凋亡，从而逃避免疫细胞的杀伤作用[6-8]；刺激小鼠肺泡的Ⅱ型上皮细胞产生H2O2及自噬相关蛋白LC3，引起细胞自噬[9]。大量研究表明铜绿假单胞菌的温度敏感株D/1/8和E/9/9、甲醛灭活的疫苗株SBI-N以及PEA类毒素可诱导小鼠产生较好的保护力[10-12]，表明PEA抗原具有作为疫苗的潜力。在此，我们将对PEA蛋白分子、融合蛋白、耦合蛋白以及核酸疫苗等的研制现状进行综述。

1 PEA蛋白分子

Gilleland等[13]将20 μg PEA蛋白加铝佐剂肌肉注射SD大鼠，初次接种后2、4周加强2次，初次接种后6周血清IgG升高，此时气管内注射5×104CFU的PA01株进行攻击，攻击后1周免疫组的肺组织病理变化显著减轻，计数存活率表明免疫组和对照组分别为72.2%（13/18）和0（0/18）。

将PEA与麦芽糖结合蛋白（MBP）或硫氧还蛋白（Trx）进行融合表达，不仅提高了蛋白的溶解性，而且有利于蛋白正确折叠和二硫键形成，最大限度地保持蛋白活性。胡晓梅[14-15]以PA01株基因组的DNA为模板扩增PEA基因，插入pSK-T得pSK-PEA，与pMAL-P2x重组得pMALPEA，将其转化大肠杆菌BL21（DE3）株，筛选重组菌，IPTG诱导表达，Western印迹提示重组菌表达的Mr为112 000的PEA-MBP融合蛋白可被阳性血清结合。赵志强等[16]将PEA基因插入pBV221得pBV221-PEA，转化大肠杆菌JM109株，筛选重组菌，40℃热诱导30 min，Western印迹提示重组菌表达的Mr为69 000的PEA蛋白可被阳性血清结合。佟伟[17]将1917 bp的PEA基因插入pET32α得pET32α-PEA，转化大肠杆菌BL21（DE3）株，筛选重组菌株，IPTG诱导表达，Western印迹提示重组菌表达的Mr为78 000的PEA-TrxA融合蛋白可被阳性血清结合。吴建勇[18]将PEA基因插入pET28α得pET28α-PEA，将其转化大肠杆菌BL21（DE3）株，筛选重组菌，Western印迹提示重组菌表达的Mr为74 000的PEA-His融合蛋白可被阳性血清结合。刘祥等[19]将50 μg PEA-His蛋白皮下注射昆明种小鼠，初次接种后2、4周加强2次，初次接种后6周血清IgG滴度为1∶8000，这时腹腔注射1×106CFU铜绿假单胞菌PA01株进行攻击感染，攻击后5 d接种组和对照组的存活率分别为 60%（12/20）和30%（4/12）。Manafi等[20]将 100 μg PEA蛋白皮下注射BALB/c鼠，每周1次，连续6周，初次接种后7周血清IgG升高，此时建立10%的体表面积烧伤模型，建模后1 d皮下注射108CFU的PA103株进行攻击感染，攻击感染后70 d接种组和对照组的存活率分别为93.8%（45/48）和0（0/25）。

KDEL是内质网留置序列，与蛋白融合表达后可以保持蛋白的全部活性。PE38是一个截短的PEA分子，含有PEA的部分结构域Ⅱ（253-362）、全部结构域Ⅰb（381-420）和结构域Ⅲ（421-613）。Qaiser等[21]以PA01株基因组DNA为模板扩增1043 bp的PE38-KDEL基因，插入pTZ57R/T得pTZ-PE38-KDEL，与pET22b（+）重组得pET22b-PE38-KDEL，将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）株，筛选重组菌，IPTG诱导，Western印迹提示重组菌表达的Mr为38 000的融合蛋白可被阳性血清结合。

用成对碱性氨基酸蛋白酶清除位点的11个氨基酸替代PEA的Ⅱ区，同时改造PEA的Ⅲ区与人Her2受体结合的6个氨基酸序列，将KDEL序列加入PE38的C端称为Her2-PE38X7。Tehranizadeh等[22]人工合成Her-PE38X7编码基因，插入pET21b（+）得pET21b-Her2-PE38X7，将其转化大肠杆菌BL21（DE3）株，筛选重组菌，IPTG诱导，Western印迹提示重组菌表达的Mr为45 500的融合蛋白可被阳性血清结合，该融合蛋白具有稳定性强、活性高和毒性低等特点。

2 PEA融合蛋白

2.1 PEA-Fla

鞭毛的基本组成单元为鞭毛蛋白（flagellin，Fla），Fla可诱导宿主产生中和抗体[23]。将PEA和Fla的编码基因融合是值得探索的方法。Tanomand等[24]以PA01株的基因组DNA为模板扩增1212 bp的PEA基因，以8821M株的DNA为模板扩增510 bp的Fla基因，采用重叠PCR合成1722 bp的PEA-Fla融合基因，插入pET22b得pET22b-PEA-Fla，将其转化大肠杆菌BL21（DE3）株，筛选重组菌，IPTG诱导，Western印迹提示阳性血清结合重组菌表达的Mr为63 000重组蛋白。Farajnia等[25]将PEA-Fla融合基因插入pTZ57R得pTZPEA-Fla，与 pET22b重组得 pET22b-PEA-Fla，将其转化大肠杆菌BL21（DE3）株，筛选重组菌，IPTG诱导，Western印迹提示重组菌表达的Mr为63 000的融合蛋白可被阳性血清结合。将20 μg重组蛋白加弗氏佐剂皮下注射BALB/c鼠，初次接种后21、42和72 d加强3次，初次接种后79 d血清IgG升高，初次接种后86 d腹腔注射7.5×107CFU铜绿假单胞菌Pa8821M株进行攻击，攻击后10 d，PEA-Fla免疫组、Fla免疫组、PEA免疫组和对照组的存活率分别为 80%（4/5）、60%（3/5）、40%（2/5）和20%（1/5）。

2.2 ntPE-M2e

若PEA的Ⅲ区553位谷氨酸残基发生突变，PEA就丧失了ADP-核糖基酶活性，成为无毒形式的PEA（ntPE）。A型流感病毒的M2蛋白胞外区（M2 extracellular domain，M2e）是一种跨膜离子通道，通过改变细胞内部的pH值促进病毒增殖。M2e的氨基酸序列保守，具有一定的免应原性[26]。徐一等[27]将M2e的编码基因插入pET30αntPE得pET-ntPE-M2e，将其转化大肠杆菌BL21（DE3）株，Western印迹提示重组菌表达的Mr为72 000的融合蛋白可被阳性血清结合。将200 μg融合蛋白加弗氏佐剂皮下注射BALB/c鼠，初次接种后3、6周加强2次，初次接种后7周血清IgG滴度为1∶7800，ELISPOT证实脾IFN-γ+SFC数目增加，初次接种后8周腹腔注射5 LD50的APR348株进行攻击感染，攻击后2周接种组和对照组存活率分别为100%（10/10）和20%（2/10）。

2.3 PEIF

外膜蛋白F（outer membrane protein F，OprF）和I（OprI）是嵌合在铜绿假单胞菌脂多糖和磷脂层外膜上的蛋白，主要参与微孔的形成，用它们免疫小鼠均可诱导较好的保护力[28]。Chen等[29]以pJH4为模板扩增PEA1-405编码基因，插入pET-15b得pET-PE，然后以PA01株的基因组DNA为模板扩增OprI19-83和OprF(24-380)编码基因，先后插入pETPE得pETIF，将其转化大肠杆菌BL21（DE3）株，筛选重组菌，Western印迹提示重组菌表达的Mr为90 000的融合蛋白可被阳性血清结合。将10 μg融合蛋白腹腔注射BALB/c鼠，初次接种后3、5周加强2次，初次接种后6周血清IgG升高，此时制作30%体表面积的烧伤模型，烧伤1 d后皮下注射5×104CFU铜绿假单胞菌PA103株进行攻击感染，攻击后10 d接种组和对照组的存活率分别为80%（8/10）和0（0/10）。

2.4 PEA-GP5-M

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是猪繁殖与呼吸综合征的病原体。包膜糖蛋白GP5和非糖基化的膜蛋白M通常形成异二聚体，与巨噬细胞的CD163受体结合，在病毒侵袭中起作用，同时可诱导中和抗体产生[30]。Yang等[31]制备PEA-GP5-M融合蛋白，将3 mg融合蛋白加1 mL ISA206佐剂肌肉注射28 d龄的仔猪，初次接种后2周加强1次，初次接种后4周血清IgG升高，ELISPOT提示PBMC中IFN-γ+SFC数目增多，此时肌肉注射5×105TCLD50铜绿假单胞菌TC-01株进行攻击，攻击后3周免疫组的肺病理变化明显减轻。

2.5 CVN-PE38

CVN是蓝细菌（Nostoc ellipsosporum）分泌的一种蛋白质，可与Ⅰ型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）的gp120结合，具有抗病毒作用。Mori等[32]将CVN的编码基因L插入pPB57得pPB57-L，与pUC19-PE38重组得pPB57-L-PE38，将其转化大肠杆菌BL21（DE3）株，筛选重组菌，IPTG诱导，Western印迹提示重组菌表达的Mr为49 300的融合蛋白可被阳性血清结合，H9细胞模型提示该融合蛋白可提高gp120+H9细胞的毒性。

2.6 PEA-V3MV26

Mrsny等[33]将HIV-1的gp120蛋白V3环26个氨基酸插入PEA的Ⅰb区，称为PEA-V3MV26，然后将20 μg融合蛋白加弗氏佐剂皮下注射BALB/c鼠，初次接种后2、7周加强1次，初次接种后8周免疫鼠的血清IgG、IgG1、IgG2a和IgG3水平明显提升，唾液IgA水平也显著升高。

2.7 PEA-HphA

HphA基因编码一种组氨酸类似蛋白，该蛋白具有结合DNA的特性。PEA的Ⅰa区和Ⅱ区结构域可作为受体介导的基因传递载体，HphA基因与其融合并不影响DNA的序列或形态，可以提高DNA的转染效率。Deng等[34]将HphA基因插入pET26α-PEA得pET26α-PEA-HphA，将其转化大肠杆菌BL21（DE3）株，筛选重组菌；Western印迹提示重组菌表达的Mr为50 000的融合蛋白可被阳性血清结合。研究提示该融合蛋白可增加质粒转染CHO细胞的效率。

2.8 IL-18-PE38

PE38具有极强的细胞毒性，常被用作分子佐剂[35]。IL-18是一种Th1型细胞因子，可将IL-18与PEA融合表达，利用IL-18将PEA导向Th1靶细胞，发挥其杀伤作用，常用于自身免疫性疾病的治疗。李虹等[36]以小鼠总RNA为模板扩增480 bp的IL-18基因，插入pRKL459K得pRKLIL-18-PE38，将其转化大肠杆菌 BL21（DE3）株，筛选重组菌，Western印迹提示重组菌表达的Mr为56 000的融合蛋白可被阳性血清结合。

3 PEA耦合蛋白

3.1 PEA-LPS

化学耦联常用于病原体的蛋白、多肽和多糖疫苗，通过与载体蛋白的耦联，使它们成为全抗原，从而提高耦联抗原的免疫原性。PEA是一种T细胞依赖性抗原，常作为半抗原的连接载体，从而提高半抗原的免疫原性[37]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是铜绿假单胞菌的内毒素，可诱导宿主产生抗体反应[38]。Cryz等[39]将PEA与LPS耦合为PEA-LPS，然后将50 μg耦合物加铝佐剂肌肉注射新西兰大白兔，初次接种后14、28 d加强2次，初次接种后42 d血清IgG升高。接着，Schaad等[40]将25 μg耦合物肌肉注射囊性纤维化的患者，初次接种后2、12个月加强2次，初次接种后13个月治疗组的血清IgG升高。

3.2 PEA-CSP

恶性疟原虫（Pf）是恶性疟的病原体，Pf环子孢子蛋白（PfCSP）是一种红前期抗原，Mr通常为40 000～60 000，在子孢子入侵肝细胞的过程中发挥作用。Fries等[41]将400 μg CSP-PEA加铝佐剂肌肉注射19名健康志愿者，初次注射后8周加强1次，初次注射后10周52%（11/19）接种者的血清IgG大于9.8 μg/mL；初次注射后16周加强第2次，初次注射后20周40%（4/10）接种者的血清IgG大于6 μg/mL。此时用2只感染Pf的斯氏按蚊叮咬接种者5 min，叮咬后2周免疫组和对照组的原虫血症分别为25%（1/4）和33.3%（1/3），研究表明免疫组的血清可抑制Pf子孢子入侵肝细胞，抑制率为90%，但抑制率与保护力无关联。

3.3 PEA-Pfs25

Pfs25是Mr为25 000的受精后抗原，在动合子穿透蚊胃上皮以及动合子转为卵囊的过程中起重要作用。钱锋等[42]将Pfs25与PEA耦联为Pfs25-PEA。Shimp等[43]将2.5 μg耦合物加铝佐剂皮下注射CD1鼠，初次接种后4周进行加强，血清IgG在首次注射后6～15周提升明显，首次注射后6周提升到较高水平；膜饲养试验表明，1∶4和1∶8稀释的初次接种后6周鼠血清的减囊率分别为99.0%和91.6%，而对照血清为0。

3.4 CD4-PEA

CD4是HIV-1结合T细胞的受体，Berger等[44]证实CD4-PEA耦合物可选择性杀伤HIV-1感染的T细胞，但不杀伤表达MHCⅡ类分子的正常T细胞。

3.5 G17-PE38

胃泌素 17（gastrin 17，G17）是缩胆囊肽 2R（CCK2R）的受体。G17-PE38是一种免疫毒素，通过G17与胃癌细胞上的CCK2R受体结合，将PE38靶向胃癌细胞，发挥细胞毒作用。Feng等[45]将G17-PE38融合基因插入pET28α得pET28α-G17-PE38，将其转化大肠杆菌BL21（DE3）株，筛选重组菌，Western印迹提示表达的Mr为43 000的融合蛋白可被阳性血清结合，细胞毒试验表明该蛋白对胃癌细胞株BGC-823、MGC-803和SGC-7901均具有细胞毒作用。

3.6 PLGA-PEA

多聚乳酸羟乙酸（PLGA）是一种可生物降解的多聚体，由其包裹形成的纳米颗粒可增强抗体的免疫应答，可作为抗原的传递载体[46]。Zanjani等[47]用PLGA包裹PEA，形成PLGA-PEA耦合物。将100 μg耦合物肌肉注射BALB/c鼠，初次接种后2、4周加强2次，初次接种后6周血清IgG提升显著，脾细胞产生大量IL-4、IFN-γ、TNF-α和IL-17A等活性分子，这时腹腔注射1.5×108CFU的PA01株进行攻击感染，攻击后3 d接种组的脾脏内细菌负荷显著减少。

4 PEA核酸疫苗

4.1 反义RNA

反义RNA在RT+细胞内反转录一个无毒性的RNA，与表达毒素的cDNA结合，抑制其转录，导致细胞死亡。反义RNA治疗并不依赖反转录（RT），因它不表达有意义的毒素，但能降低转染细胞的活性。HaHafkemeyer等[48]将PEA的反义RNAP92、P95、77和 P100插入 pCMVβGa1得pCMV-P92/P95/p77/P100，将其转染鸭乙肝病毒（DHBV）感染的HepG2细胞，筛选培养，RT-PCR证实重组质粒可抑制DHBV的转录。

4.2 重组质粒

Denis-Mize等[49]以pGW580为模板扩增PEA基因，插入 pVR1012得 pVR1012-PEA，转染UM449细胞，筛选培养，Western印迹提示阳性细胞表达的Mr为67 000的PEA蛋白可被阳性血清结合。将100 μg重组质粒肌肉注射BALB/c鼠，血清IgG在接种后3～5周升高，接种后5周达较高水平；RT-PCR证实接种后35 d淋巴结细胞内IFN-γ mRNA转录增加，但IL-4无变化；此时腹腔注射2.6 μg PEA毒素进行攻毒试验，10 d后接种组和对照组的存活率分别为80%（8/10）和0（0/10）。Shiau等[50]将 1.66 kb的 PEA 基因插入pSecTagXpress得pSecTag-PEA，将其转染3T3细胞，筛选培养，Western印迹提示阳性细胞表达的Mr为62 000的PEA蛋白可被阳性血清结合；借助肌肉注射将100 μg重组质粒接种BALB/c鼠，首次注射后2、4、6和8周重复4次，血清IgG在首次注射后3～11周提升明显，首次注射后9周提升到较高水平；首次注射后10周腹腔注射1 μg PEA毒素进行攻击，攻击后1周免疫组和对照组的存活率分别为100%（5/5）和0（0/5）。

铜绿假单胞菌低钙反应蛋白V（P.aeruginosalow-calcium response protein V，PcrV）是一种Ⅲ型分泌系统（T3SS）的转运蛋白，具有一定的免疫原性[51]。Jiang等[52]以PA01株基因组的DNA为模板扩增PEA和PcrV基因，将其分别插入pIRES的2个位点得pIRES-PEA-PcrV，将重组质粒转染HEK-293细胞，筛选培养，Western印迹提示感染铜绿假单胞菌的血清可结合阳性细胞表达的Mr为70 000的PEA和33 000的PcrV蛋白；借助肌肉注射将100 μg重组质粒注射BALB/c鼠，首次注射后2、4周重复2次，首次注射后5周血清IgG升高，脾细胞增殖，分泌高水平的IFN-γ和IL-12；初次接种后6周用5×107CFU铜绿假单胞菌PA01株进行滴鼻攻击，攻击后3 d免疫组的肺组织病理变化减轻，肺组织内的细菌负荷大量减少。

5 结语

现有部分铜绿假单胞菌PEA蛋白疫苗接种小鼠可产生免疫应答，但诱导的保护力水平一般较低，离期望值甚远。重组PEA抗原的免疫原性较低，常须加用佐剂或与其他抗原进行融合以及耦合表达才能诱导有效的保护力；核酸疫苗可诱导全面的细胞和体液免疫应答，但其有整合进宿主基因组的风险；尚未深入研究这些疫苗的免疫机制；尚未建立疫苗效果的标准化和规范化的评价体系；尚未弄清疫苗的免疫途径、剂量、次数、间隔以及末次免疫后菌株攻击时间；尚欠缺新型PEA疫苗研制的创新思维。

随着核基因组学、泛基因组学、蛋白质组学、高通量测序和反向疫苗学等学科的进展，大家势必聚焦铜绿假单胞菌的基因组学、蛋白质组学及代谢组学的研究，从而阐明PEA结构与功能的关联；为了提升DNA疫苗的免疫效果，可对PEA抗原表位的序列进行修饰，构建PEA多抗原表位或免疫增强序列-PEA抗原表位的融合基因疫苗，构建PEA表位-佐剂序列或不同抗原表位序列的融合基因疫苗；同时应努力探索新型疫苗载体，多管期下，积极推动铜绿假单胞菌PEA蛋白疫苗的研究步伐。