不同月份豆腐柴叶果胶理化性质差异研究

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(1.西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010;2.四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心,四川绵阳 621010;3.江油市春雨生态农业科技有限公司,四川江油 621700)

豆腐柴(PremnamicrophyllaTurcz)是唇形目马鞭草科豆腐柴属植物,直立灌木,叶片揉之有臭味,呈卵状披针形、椭圆形或倒卵形[1]。果胶(Pectin)是一种由半乳糖醛酸聚合而成的天然高分子化合物,广泛存在于植物的果实、根、茎、叶中,具有良好的胶凝性和乳化稳定作用,主要应用于食品工业[2-3]。因豆腐柴叶片富含果胶和多种营养成分,民间多摘取叶片制作“树叶凉粉”[4-5]。

目前,国内外关于豆腐柴叶的研究报道主要集中在其营养成分、果胶提取工艺及基本理化性质、“树叶凉粉”制作等方面[6-9]。豆腐柴叶果胶理化性质的相关研究较浅,如廖雯娟、王媛莉[10-11]仅对其基本性质、结构和组分进行了初步探究。关于“树叶凉粉”的报道也仅停留在制作工艺的优化阶段,并未深入研究。前期实验研究发现,不同月份豆腐柴叶制作的“树叶凉粉”品质参差不齐,“树叶凉粉”能够凝结成型主要其含有的大量果胶,而果胶凝胶的形成与果胶浓度、酯化度、黏度等理化性质有关[7-9]。

为探究“树叶凉粉”品质不一的原因,提高豆腐柴叶加工利用价值,本文以四川江油地区豆腐柴叶为原料提取制备果胶,对不同月份果胶得率、主要成分、结构、乳化性、凝胶性等理化性质进行比较分析,采用主成分分析法综合评价不同月份果胶品质,以寻求品质更优、应用价值更高的果胶产品,为更加全面了解四川江油豆腐柴叶果胶的性质及“树叶凉粉”的加工工业化提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

豆腐柴叶 每月(5～11月)12日采摘于四川绵阳江油豆腐柴基地(江油市春雨生态农业科技有限公司),将新鲜叶子清净,置于50 ℃恒温烘箱中烘干、粉碎、过60目筛,低温保存备用;半乳糖醛酸标准品(≥97%) 美国Fluka公司;咔唑、橘皮果胶标品 美国Sigma公司;盐酸、浓硫酸、无水乙醇等 分析纯。

3nh色差仪 深圳市三恩驰科技有限公司;UItra55场发射扫描显微镜 德国蔡司仪器公司;Frontier红外吸收光谱 美国Perkinelmer公司;TA.XT Plus质构仪 英国Stable Micro Systems公司。

1.2 实验方法

1.2.1 豆腐柴叶果胶制备 参照张攀等[12]的酸提取法进行提取分离,采用真空冷冻干燥24 h、粉碎、过60目筛得果胶粉末。橘皮果胶标品、不同月份豆腐柴叶果胶粉末分别用P0、P5月、P6月、P7月、P8月、P9月、P10月、P11月表示。

1.2.2 果胶主要成分分析 果胶灰分、酸不溶灰分的测定参照GB 25533-2010《食品安全国家标准 食品添加剂 果胶》进行;钙含量的测定参照GB/T 6436-2002《饲料中钙的测定》中高锰酸钾法进行;果胶得率、半乳糖醛酸、酯化度指标的测定参照张攀等[12]的方法进行;粘均分子量测定参考朱春丽[13]的方法并略作修改,室温条件下,用0.1 mol/L的磷酸溶液将果胶溶解,配制成0.1～2 g/L的果胶溶液,用乌氏粘度计测出果胶的固有粘度并进行计算。

1.2.3 色差分析 用色差仪直接测定果胶粉末的色泽,以标准白板为参照。

1.2.4 扫描电镜分析 取适量干燥的果胶粉末用双面导电胶粘附在SEM样品台上,喷金后观察果胶微观形态并使用电镜扫描拍照。加速电压为20 kV,放大倍数分别为500倍和10000倍[14]。

1.2.5 红外光谱分析 取2 mg果胶粉末,与100 mg溴化钾研磨混合后压片制样,采用红外吸收光谱仪在400～4000 cm-1范围内进行红外光谱扫描[14]。

1.2.6 乳化性测定 参照吴国利等[15]的方法。在带刻度的10 mL透明塑料离心管中添加2 mL玉米油和2 mL 0.5%果胶溶液,10000 r/min条件下均质2 min得到乳化液;然后在1000 r/min转速下离心5 min,读取整个体系的体积(WV)和乳化层体积(ELV)。

乳化活性(EA)计算公式为:EA(%)=(ELV/WV)×100。

准备四支离心管,果胶溶液按照同样的方法制备乳化液,在1000 r/min下离心5 min后读取乳化层体积(ELVi),分别于4、23 ℃储藏1、5 d后1000 r/min离心5 min读取乳化层体积(ELVr)。

乳化稳定性(ES)计算公式为:ES(%)=(ELVr/ELVi)×100。

1.2.7 凝胶性测定 参考江杨[16]的方法。准确称取0.5 g果胶粉末和1.5 g蔗糖,混合后加入适量pH为3.0的缓冲液,缓缓加热到沸腾状态并搅拌4 min左右,然后倒入可溶性固形物含量为70%、体积为30 mL的95 ℃溶液中,快速搅拌约1 min后冷却至室温,搁置24 h后形成0.5%的果胶凝胶。采用TA-XT.Plus物性测定仪,压缩测试使用柱形探头(5 mm半径,PC-0.5R),TPA模式,测前、测中、测后速度均为1.0 mm/s,下压15 mm,触发力2 g,穿刺胶体。

1.2.8 主成分分析 参考公艳等[17]的方法。主成分分析法主要依据各指标对综合评分的平均权重系数进行分析,通过将多个原始变量降维转变为几个新指标,即主成分来反映指标信息。运用SPSS 22.0软件对原始变量进行降维、提取分析,可得到原始数据的特征值、贡献率及累积贡献率,对特征值大于1的因子提取主成分,获得综合评价值。

1.3 数据处理

所有实验均重复3次,结果用平均值±SD表示。运用Microsoft Excel 2013和SPSS 22.0软件进行数据处理,显著性分析采用单因素方差分析(ONE WAY ANOVA)进行S-N-K法分析,Origin 8.5软件绘制图形,Photoshop CS6软件处理图像。

2 结果与讨论

2.1 不同月份豆腐柴叶果胶主要成分分析

P0和P5月～P11月主要成分测定结果如表1所示。豆腐柴叶果胶得率为4.24%～18.24%,从高到低依次为P8月>P7月>P6月>P9月>P5月>P10月>P11月,P8月得率极显著(P<0.01)高于其它月份,这可能与8月气候炎热、光照充足,豆腐柴叶新陈代谢强,有利于促进果胶合成有关。

表1 不同月份豆腐柴叶果胶的主要成分Table 1 The main components of pectin from Premna microphylla Turcz leaves in different months

注:-表示标准中未说明或无法测得该数据;同行大写字母不同表示差异极显著(P<0.01),同行小写字母不同表示差异显著(P<0.05),表2、表4同。

P5月～P9月得率相对较高,若将5月～9月的豆腐柴叶用于果胶提取能相对提高豆腐柴叶利用率。

P5月～P11月除酸不溶灰分外,其它指标均达到了国家标准。豆腐柴叶果胶半乳糖醛酸含量为73.73%～81.96%,从高到低依次为P7月>P6月>P9月>P8月>P5月>P10月>P11月,P7月极显著(P<0.01)高于其它月份,说明P7月纯度最高。P5月～P11月酯化度均大于50%,属于高酯果胶,比蒋立科等[9]的研究结果略高,说明豆腐柴叶地区来源或提取工艺对果胶酯化度可能有影响。P5月～P11月灰分和酸不溶灰分含量极显著(P<0.01)高于P0,可能是因为豆腐柴叶果胶含有较多的矿物元素,这也可能是酸不溶灰分未达标的原因,通过对钙含量的测定发现豆腐柴叶果胶确实含有较多的钙。豆腐柴叶果胶的粘均分子量是橘皮果胶标品的1.6～1.9倍,不同月份豆腐柴叶果胶粘均分子量差异较大,呈先增大后减小的趋势,说明相同浓度下,豆腐柴叶果胶粘度大于橘皮果胶标品粘度,且不同月份豆腐柴叶果胶粘度有差异,这可能是不同月份“树叶凉粉”品质不一的主要原因。

表2 不同月份豆腐柴叶果胶粉末色差分析Table 2 Color analysis of pectin powder from Premna microphylla Turcz leaves in different months

2.2 不同月份豆腐柴叶果胶色差分析

果胶粉末颜色如图1所示,肉眼观测P0呈白色,P5月～P8月呈淡黄色,P9月和P10月呈淡黄夹灰白色,P11月为灰黑色结块,除P11月外,其它月份果胶色泽和外观均符合GB 25533-2010标准。由于11月份气温明显下降,果胶合成受阻,且叶子含有较多不易除去的色素类物质,从而留在提取出的果胶中,导致P11月得率低且外观色泽不符合标准,因此11月份豆腐柴叶已不适合用于果胶的提取和“树叶凉粉”的制作。

图1 不同月份豆腐柴叶果胶粉末颜色Fig.1 Powder color of pectin from Premna microphylla Turcz leaves in different months

为更加准确辨别果胶粉末色泽,采用色差仪进行测定其结果如表2所示。L*表示亮度,其值大小依次为P0>P6月>P7月>P5月>P8月>P9月>P10月>P11月,P0极显著(P<0.01)大于P5月～P11月,P6月极显著(P<0.01)大于其它月份,表明P5月～P11月亮度不如P0,不同月份间P6月亮度最好,与朱春丽[13]的籽瓜皮果胶L*值69.85接近。a*为正值时表示红度,为负值时表示绿度;b*为正值时表示黄度,为负值时表示蓝度;c*表示色差饱和度。b*均为正值,且b*和c*排序一致,其值大小依次为P5月>P7月>P6月>P8月>P9月>P10月>P0>P11月,P11月极显著(P<0.01)低于其它月份,表明P11月黄色最浅,这与肉眼直接观测到的果胶粉末黄色深浅一致。与朱春丽[13]的籽瓜皮果胶b*值9.72相比,豆腐柴叶果胶黄色更深,这可能与果胶原料来源和制备工艺不同有关。

2.3 不同月份豆腐柴叶果胶扫描电镜分析

图2所示是果胶在扫描电镜下分别放大500倍和10000倍所观察到的形态结构。可以看出,P0在500倍时呈不规则条状、块状,在10000倍时呈网络片状、表面较光滑;放大500倍时,P5月～P9月呈块状、厚片状,P10月和P11月表面有较多褶皱;放大10000倍时,P5月～P11月呈片状、絮状,表面有球状物。橘皮果胶标品和豆腐柴叶果胶在放大500倍时呈现出不同的形态,这可能是因为果胶原材料来源不同。P5月～P11月的形态差异说明不同月份对豆腐柴叶果胶表面形态有影响,具体影响机理还有待进一步探究。放大10000时,P5月～P11月与张攀等[12]的P1呈现完全不同的形态,本文的果胶和张攀等[12]P1的制备方法除干燥方式外都相同,本文采用真空冷冻干燥,而P1采用热风干燥,说明果胶的表面结构与果胶制备干燥方式有关。

图2 不同月份豆腐柴叶果胶电镜扫描图Fig.2 SEM images of pectin from Premna microphylla Turcz leaves in different months

图3 不同月份豆腐柴叶果胶红外光谱图Fig.3 IR spectroscopy of pectin from Premna microphylla Turcz leaves in different months

2.4 不同月份豆腐柴叶果胶红外光谱分析

图3所示是果胶的红外光谱图,P0和P5月～P11月在400～4000 cm-1范围类均表现出糖类的特征吸收峰。3433 cm-1附近出现的吸收峰是O-H键的伸缩振动,2928 cm-1处是C-H键的伸缩振动,1746～1751 cm-1处的吸收峰为羧羰基和酯羰基中C=O键的伸缩振动,1632～1638 cm-1处的吸收峰为游离羧基中C=O键的非对称伸缩振动,这两个特征峰证明提取物为果胶类多糖[18-21]。1444 cm-1处吸收峰是由-COOH的C-O伸缩振动引起的,证明有果胶特征基团羧基的存在;1261～1268 cm-1和880 cm-1附近的吸收峰是S=O键的伸缩振动,说明果胶含有硫酸根[22-25]。P0和P5月～P11月反映出的官能团信息一致,表明P0和P5月～P11月具有相似的化学结构。但P5月～P11月出现峰值的位置和吸收强度有差异,如1746～1751和1632～1638 cm-1范围的C=O键振动,各月份峰位置略有不同;1400～1200 cm-1出现的C-H键变角振动,P5月在1444 cm-1处没有吸收峰,其余月份均在此处出现吸收峰;从局部放大图可以看出各月份相同位置峰的吸收强度也有差异。吸收峰的位移和峰面积与质量效应、电子效应、空间效应等密切相关,这表明不同月份豆腐柴叶果胶的组成及空间结构有细微差别[26]。

2.5 不同月份豆腐柴叶果胶乳化性分析

P0和P5月～P10月溶液(P11月得率低且溶解困难,无法得到要求浓度的果胶溶液)乳化活性和乳化稳定性结果如表3所示。在23 ℃下,P5月～P10月乳化活性均大于50%,且差异不显著(P>0.05),但显著(P<0.05)高于P0,说明豆腐柴叶果胶乳化活性大于标品。P5月～P10月乳化液在4 ℃下储存1 d时,乳化稳定性为51.35%～56.41%,P5月～P9月差异不显著(P>0.05),P10月稳定性相对较低;在23 ℃下储存1 d时,乳化稳定性为49.88%～55.89%,P5月～P9月差异不显著(P>0.05),P10月稳定性显著(P<0.05)低于P5月～P9月;对比4、23 ℃分别储存1 d的稳定性发现,豆腐柴叶果胶在低温下更加稳定。P0和P5月～P10月储存5 d之后,乳化稳定性都有下降,但P5月～P10月下降幅度小一些,说明豆腐柴叶果胶更加稳定。综合比较发现豆腐柴叶果胶乳化性优于橘皮果胶标品。

表3 不同月份豆腐柴叶果胶乳化性Table 3 Emulsifying characteristics of pectin from Premna microphylla Turcz leaves in different months

注:同列小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。

表4 不同月份豆腐柴叶果胶凝胶性Table 4 Gel characteristics of pectin from Premna microphylla Turcz leaves in different months

2.6 不同月份豆腐柴叶果胶凝胶性分析

P0和P5月～P10月凝胶质构(P11月得率低,溶解困难,无法形成凝胶)在TPA模式下测定结果见表4。各月份硬度差异极显著(P<0.01),P6月粘性极显著(P<0.01)低于其它月份;内聚性和回复性变化趋势一致,P6月内聚性显著(P<0.05)高于P5月、P7月～P9月,P10月内聚性显著(P<0.05)低于其它月份,各月份回复性差异不大;胶粘性和咀嚼性变化趋势一致,且P7月极显著(P<0.01)高于其它月份。同种果胶形成凝胶过程中,高甲氧基果胶通过羟基、羧基、氢键的自身或相互作用使高聚半乳糖醛酸发生部分交联形成了三维网状结构,将其它溶质(可溶性固形物)和水包裹进了晶型网状结构中,硬度、粘性、胶粘性、咀嚼性指标均与此有关[27]。而内聚性的高低取决于不同基团之间的排斥程度和相同基团之间结合的紧密程度;网状结构交联程度越高,互相牵制作用越强,发生形变后要恢复时受到的阻碍越大,回复性越低[28]。综合分析,P7月～P9月各指标数据良好,凝胶性能较好,更适合作为胶凝剂。

2.7 主成分分析法综合评价不同月份豆腐柴叶果胶理化性质

运用SPSS 22.0对果胶得率等12个指标进行主成分分析,对不同月份豆腐柴叶果胶理化性质进行综合评价。由表5可知,对前三个因子(果胶得率、半乳糖醛酸含量、酯化度)进行提取时,累积贡献率达到93.29%(>85%),说明提取的三个因子可基本反映豆腐柴叶果胶的理化性质。因子成分碎石图(图4)可直观显示各因子的重要程度,前三个因子在陡坡上,特征值大于1,说明考虑前三个因子的方法是可行的[29]。由表6可知,综合评分排序为P9月>

表5 相关因子特征值及贡献率Table 5 Eigenvalues and contribution rates of related factors

表6 不同月份豆腐柴叶果胶综合评分及排序Table 6 Comprehensive scores and ranking of pectin from Premna microphylla Turcz leaves in different months

P7月>P8月>P10月>P6月>P5月>P0,豆腐柴叶果胶综合得分明显高于橘皮果胶标品,P7月～P9月综合得分明显高于其它月份。

图4 因子碎石图Fig.4 Scree plot of factors

3 结论

不同月份豆腐柴叶果胶得率为4.24%～18.24%,半乳糖醛酸含量为73.73%～81.96%,酯化度为75.75%～85.87%,具有良好的乳化和凝胶性能,表明豆腐柴叶用于提取商业果胶具有一定的可行性和实用价值。主成分分析法综合评价得分从高到低为:9月>7月>8月>10月>6月>5月,说明不同月份对豆腐柴叶果胶理化性质影响较大,7～9月豆腐柴叶果胶品质较优,更适合用于果胶的提取和“树叶凉粉”的制作。