碳同位素自然丰度分析在土壤生态系统碳动态研究中应用

姜懿珊 ，罗春玲，张干*

1.中国科学院广州地球化学研究所/有机地球化学国家重点实验室，广东 广州 510640；2.中国科学院大学，北京 110049

过去 50年来，人类因素和自然因素排放的温室气体排放驱动全球气候变暖已经成为全球广泛关注的共识。为了限制二氧化碳气体的排放，人们先后在1997年和2009年联合国气候气候变化框架公约大会上签订了《京都议定书》和《2009哥本哈根协议》。有关大气二氧化碳源、汇的问题，全球气候变化碳循环中，大气中实际的碳增量、海洋吸收碳的总增量和化石燃烧释放碳的增量都相对容易测定，而多样的陆地生态系统类型，较大的碳循环时空变异，以及当前薄弱的陆地生态系统碳循环研究（Bazzaz，1990；Koch et al.，1996），导致陆地生物圈中的土壤很可能是碳收支平衡中的一个“未知汇”。全球土壤中具有丰富多样性的生物和有机质，共同组成了一个巨大的碳库，因此成为重要的潜在温室气体的“源”和“汇”（Torn et al.，2009）。全球土壤有机碳（1 m深范围内）达到1500—2500 Pg C（Berg et al.，1993；IPCC，2000），约为全球陆地总碳量的三分之二，是大气层总碳量的2倍，植被碳库的 4倍。土壤与大气之间的碳交换量达 C 60 Pg·a-1，是全球化石燃料释放量的10倍（Fernandez et al.，1993）。森林和草地土壤约占全球土壤碳储量的39%和15%（Berg et al.，1993），是碳排放和碳固定的重要载体（IPCC，2000；Trumbore，2009）。因此，自然生态系统中土壤碳库的动态研究在全球陆地生态系统碳循环中占有重要地位。这些生态系统存在于从热带到寒带，平原到高原等多样的气候条件和生态环境当中，同时包含了对应的复杂多变的植被类型（Veresoglou et al.，2019；Wang et al.，2019）。越来越多的证据表明，自然生态系统中土壤有机碳库在频繁的人类活动干预和剧烈的气候条件变化下，越来越容易受到攻击和影响（Jin et al.，2019）。如大范围的森林砍伐导致马来西亚在过去的29年来土壤有机碳储量下降42%，印度东北部地区土壤有机碳密度显著降低（Lungmuana et al.，2018；Rahman et al.，2018）。同样的，过度开发，如草场过度放牧，导致青藏高原草地和温带草原土壤有机碳储量分别下降了26.5%（Li，2016）和33%（Xu et al.，2013）。自然生态系统中土壤有机碳相对微小的动态变化，都将导致整个土壤层有机碳库绝对量的巨大变化，继而引起与大气碳交换加剧，最终与全球气候变化产生交互影响。要预测和了解这些生态系统中土壤有机碳库对未来环境变化的响应，则需进一步完善对土壤有机碳循环核心成分碳动态的探索。在此过程中，碳同位素自然丰度由于其在自然生态系统中天然的示踪作用，成为研究土壤碳动态的新焦点。

1 碳同位素自然丰度分析在土壤碳动态研究中的指示意义

已有的土壤表层有机碳的14C年龄、土壤有机碳含量变化和土壤有机碳13C自然丰度分布特征已经表明土壤碳库是由至少3个具有不同更新周期的亚碳库组成（Townsend et al.，1995；Trumbore et al.，1989；沈承德等，2000）：活动碳库（根分泌物和快速分解的植物残体，更新周期小于1年）、易分解碳库（更新周期在数年至数百年之间）和稳定碳库（矿化有机碳，更新周期大于千年）（Trumbore et al.，1997；陈庆强，1998）。在自然生态系统中，土壤有机质作为一种持续接受植物新碳输入和承受降解作用碳损失的碳库，其自然14C/12C同时反映了放射性衰变和降解衰变（Torn et al.，2009；Trumbore，2000）。如何确定土壤有机碳在不同库中的分布及驻留时间，是运用这种区分的前提。土壤有机碳包含土壤微生物量碳以及土壤有机碳组分在内的一系列核心成分（Trumbore，2009），它们具有不同的物理化学属性和周转时间，所以传统的土壤普查方法，如土壤有机碳的组成、含量、土壤呼吸碳排放量等，很难精准的探测到几年或几十年内环境变化对土壤碳动态的影响（Del Galdo et al.，2003；Paul et al.，2002）。碳同位素测量方法，是目前唯一可以直接揭示土壤碳循环的扰动和恢复过程（De Camargo et al.，1999）中土壤有机碳库动态的研究方法。土壤有机碳的放射性同位素（14C）可用来确定碳动态变化以及全球变化对土壤碳的影响，并能用于检验土壤碳动力学模型的预测效果（Trumbore，2009）。

过去由于碳同位素自然丰度检测条件不成熟，研究人员更多地应用人工控制添加稳定碳同位素（13C）开展实验设计，成功有效地在应用在有机碳循环机制的研究中（Chunmei et al.，2020；宋斗妍等，2008）。而相比于实验室培养无法完全模拟自然环境的劣势，利用碳同位素自然丰度示踪更能真实反映自然生态系统中土壤碳动态的变化。近年来，随着分析技术的发展，尤其是加速器质谱技术的出现，使检测单体化合物（如生物标志物PLFA）中低浓度的14C自然丰度也得以实现（Carbone et al.，2010；Czimczik et al.，2005；Hanson et al.，2005）。这使13C和14C同位素自然丰度分析方法成为研究不同时间尺度自然生态系统中土壤有机碳动态的一个强有力的工具。其中，土壤有机碳的稳定碳同位素（13C）的自然丰度综合了几年到数十年尺度植被的同位素信息，成为评价生物碳同位素组成变化的最佳观测指标（Bird et al.，2004）。1950—1960年代进行的核试验所释放的14C使大气14C水平上升了约1000%并由大气沉降作用逐年下降。在此过程中，14C水平成为了天然地示踪因子，明确地区分出高14C水平代表的新土壤有机质和低14C水平代表的老土壤有机质。计算大气14C与不同周转速率土壤组分耦合后的14C水平，便可以清楚地评估这一地区土壤有机碳的周转状态（Harkness et al.，1986；Trumbore et al.，1989）。

2 微生物 PLFA的碳同位素自然丰度分析技术

生态系统固定CO2的能力主要依赖于它们固定碳产物的产量和保持碳的时间（Fung et al.，1997），而土壤微生物是将CO2转化为土壤有机质的核心动力（Torn et al.，2009）。土壤有机质由一系列不同周转时间的组分组成，通过这些组分的碳同位素水平可以直接反映环境因素对土壤碳组分动态变化的影响程度。比如在土地改用以后，通过碳同位素水平估计新植被类型输入后对土壤有机质造成的影响，计算旧植被残体及保留时间的指数式衰减（Gleixner et al.，1999）。有科学家通过土壤稳定同位素（13C）水平检测，发现在植被改变23年后土壤主体中糖和蛋白质的13C水平才开始减少（Gleixner et al.，2002）。由此可见，土壤有机质并不都能很快的从同位素水平反映出环境条件的变化。然而，土壤有机质的不稳定性和易降解性，使得微生物得以对新老有机碳进行利用并快速循环（Gleixner et al.，2005），但在讨论生态系统对全球环境变化的响应时，它经常被忽略（Jennifer et al.，2020）。生物通过光合作用固碳、再通过呼吸作用或降解作用，将一部分碳返还给大气的平均周转时间，是评价生态系统在外界环境变化（如气候变化）下，碳储存和释放改变时间和改变程度的重要评价指标（Thompson et al.，1996）。而通过对土壤有机碳组分和微生物量碳同位素水平的综合评估，可以进一步生态系统中土壤碳库动态变化以及不同微生物的碳周转特性进行评价。

目前利用碳同位素技术研究微生物量碳动态主要通过活体土壤微生物标志物磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acids，PLFAs）来实现。PLFA是微生物细胞膜的主要组成成分，具有比较稳定的化学性质，不容易在提取过程中丧失或转化（Frostegård et al.，1991）。由于不同微生物细胞膜脂类结构的差异，不同PLFA可以对来对不同的功能微生物进行识别。如亚麻油酸（C18:2ω2）可用作真菌的标记物，β-OHFA则用作革兰氏阴性细菌的标记物（Zelles，1999）。细胞死亡后微生物细胞膜最多一周之内便会被水解，因此，PLFAs可以作为理想的研究微生物活细胞群体的生物标记物。活体微生物细胞膜中的磷脂通常有着与微生物碳源直接相关的碳同位素指纹特征（Boschker et al.，2002）。这已经广泛用于在实验室培养的13C添加实验研究中指示土壤微生物的碳源（Abraham et al.，1998；Hanson et al.，1999）。而14C自然丰度分析作为一种可以精准测量微生物群落脂类14C水平的手段，与PLFAs方法相结合，可以更加准确的获得微生物的碳源以及碳周转速率的信息。例如，通过土壤中PLFA的14C含量的差异，可以评估石油污染地区，微生物的修复作用，即微生物否以污染物为碳源（Ahad et al.，2013；Cowie et al.，2010；Mahmoudi et al.，2013；Mills et al.，2013；Slater et al.，2006；Slater et al.，2005）。在环境科学标准参考物质的研究进展中，PLFA的单体碳同位素自然丰度分析（Compound specific radio carbon analysis，CSRA），在配备加速质谱（accelerator MS，AMS）后得以实现，使自然生态系统中特定微生物量碳动态信息可以被直接指示和收集（Cowie et al.，2010；Eglinton et al.，1997；Li et al.，2012；Uchikawa et al.，2008）。

3 碳同位素自然丰度分析在土壤碳动态研究中的应用

3.1 土壤有机碳动态

过去几十年的研究已经较清楚的显示了土壤有机质固定的机制和时间问题，然而对其过程，我们却缺乏足够的了解，因此要预测土壤有机碳在不同土壤类型、地貌和一定的气候和环境条件变化下的响应存在很大的不确定性（Trumbore，2009）。部分原因在于过去的研究多集中在小范围的、短时间尺度上的土壤碳平衡过程。例如，过去的土壤碳模型研究多集中于土壤表层20 cm（Jenkinson et al.，1977；Parton et al.，1987），而事实上，较大部分的土壤有机碳是储存在地表 20 cm以下的土壤中（Jobbágy et al.，2000），相应地，评估这部分是否高度稳定对于研究土壤动态来说非常重要（Kramer et al.，2008；Rethemeyer et al.，2005）。因此，要了解区域性土壤有机碳的动力学过程，长时间尺度地和大范围的研究十分重要。

对于那些有明确记录的植被类型变化的生态系统（通常是C3植被改种C4植被），新旧植被光合产物对土壤投入13C水平的差异，可以在几十年时间范围内通过土壤有机质13C的变化速率反映出来（Balesdent et al.，1987）。土壤有机碳13C的自然丰度在土壤剖面中的分布和富集也可以在一定程度上反映生态系统中环境变化对土壤碳库的影响（于贵瑞等，2005）。这种方法在碳动态研究中提供了许多重要的证据，然而对于确定的、单独自然因素改变的需要使得其不能被广泛应用于自然土壤生态系统当中，也不能可靠地反映千年时间范围内的碳动态研究。

14C有效地弥补了13C在时间范围上的限制，是目前唯一可以解决土壤有机碳较长时间尺度，十年至千年尺度动力学过程的工具（Levin et al.，2000）。14C作为良好的示踪剂且直接与碳本身相关，早在1960s末就用作标记物用于土壤腐殖质的研究（Campbell et al.，1967）。而随着对核爆14C认识的加深，核爆14C作为理想的示踪剂且在各生态系统广泛存在，自1970s末开始广泛应用于揭示土壤有机碳碳库大小、碳输入率和更新方面（O'Brien et al.，1978；Trumbore，1993）。

为了预测土壤有机碳在长时间尺度上的变化，有关土壤有机碳14C的模型研究是研究土壤有机碳动力学研究的重点之一。但目前有关研究中可以矫正模型的野外实测土壤有机碳组分14C自然丰度数据仍然较少（Wang et al.，2002）。随着近年来全球土壤有机碳的14C数据库的完善，研究人员在应用实测土壤有机碳的14C数据对 global land model（ELMv1-ECA）和Earth System Model（E3SM）模型的预估进行统计对比发现，深层土壤有机碳的碳周转被严重低估了（Chen et al.，2019）。大部分土壤有机质14C研究应用于单个土壤剖面中，将这些点扩散到面需要一个可以在多维角度预测这些因素对碳储量和碳动态变化的框架设计。目前比较认同的框架设计是state factor方法（Amundson et al.，1997；Torn et al.，2009）：将可测量的土壤性质（如有机质含量）与state factor联系起来，包括气候，植被，基质，地形和时间。Amundson & Jenny在1997年又基于人类对地表塑造的巨大影响增加了第6种state factor：人类活动。这个框架的价值在于，在开展研究过程中，我们可以在取样时缩小其它 state factor差距，再分离研究其中某种state factor的影响。基于以上理论，土壤有机碳组分的14C的自然丰度分析可以从以下几个方面用于定量研究土壤碳动态过程：

（1）测算土壤中某恒定物质的碳年龄。如果碳自进入土壤中一直没有与土壤环境中其它的碳进行交换，那么我们就可以通过测试土壤有机碳的14C年龄，来判断土壤有机碳形成的时间（Trumbore et al.，1997；沈承德等，2000）。那些公元1960年以前固定的碳，放射性碳同位素测算要进行大气14C波动校正。这种波动校正的精密度有限，因此14C在区分公元前1650至公元1950年固定的碳年龄时，可能不是十分准确。但是对于自1960以来形成的土壤有机碳14C年龄误差可减少到1—2年。这种手段也可以应用于烧焦的样品材料（Pessenda et al.，2001）或指认未完全分解的有机质残片中（Trumbore et al.，1997），因为在这部分土壤的有机碳中可能有未分解的碳化物质或可识别的植物残体。

（2）指示土壤碳库与大气碳库之间的碳交换速率。土壤是一个开放系统，新鲜土壤有机质源源不断地从这个系统中进出。1960年以前的有机质的14C水平可以推测其对大气14C的平均分解速率（Torn et al.，1997）。核试验所产生14C的加入使14C水平变为示踪近几年、几十年甚至几百年土壤地气交换的一个更灵敏的示踪因子，从而估算土壤有机碳平均的分解速率（Agnelli et al.，2010）。14C所反映出的时间是大气碳原子通过植物固定后开始计算的，因此并不需要进行植物分解速率的直接测量就可以获得它们对大气有机碳降解速率的信息。通过土壤有机碳组分的14C自然丰度分析，可以对自然生态系统中土壤有机碳的周转速率进行评估，从而评价土壤碳循环中重点关注的温度等气候影响因素的影响（Jinquan et al.，2020）。

（3）示踪物质来源。例如比较不同土壤呼吸二氧化碳或土壤中二氧化碳气体与其潜在来源的碳同位素值来分析哪种基质作为碳源，判断其主要来源（Trumbore，2006）。这虽然通过生态学观测的方法也能取得，但往往存在较大的不确定性（Hanson et al.，2000）。例如，研究人员通过对比鼎湖山森林土壤中有植被覆盖和没有植被与根系分布情况下二氧化碳气体来源比例后指出，微生物分解作用可能是土壤二氧化碳气体的主要来源，但是由于两者并非同一剖面，因此结果存在不确定性（Yi et al.，2007）。运用碳同位素方法，丁平等发现在同一片林区和时期（雨季）植被覆盖程度不同，差异非常大，植被茂密的剖面土壤二氧化碳气体主要来源于根系呼吸（80%），而植被稀疏的剖面土壤二氧化碳气体主要来源于微生物分解作用（68%），深部土壤中的二氧化碳主要来源于表层 0—20 cm土壤有机碳的分解（丁平等，2010）。近期针对森林改种土壤中土壤有机碳动态的研究发现，表层30 cm土壤有机碳的碳动态明显受到植被转换的影响，而深层土壤有机碳变化不明显（Jiang et al.，2020）。

3.2 土壤微生物量碳动态

PLFA的13C示踪已广泛应用于实验室培养实验中微生物对外源添加物的代谢特性研究中，包括有毒底物、有机物料以及葡萄糖碳等等（宋斗妍等，2008）。而PLFA单体的13C自然丰度目前最直接的指示意义就是可以区分不同微生物的植物碳源是来自C3或C4植被，因此通常被用于C3—C4植被演替下耕作土壤微生物的研究中，用于指示短期内植被改变后不同微生物对植物碳代谢的变化（Balesdent et al.，1987；Boschker et al.，1998；Kramer et al.，2006）。如 Kramer et al.（2006）在对两个经历了植被演替的农田土壤中PLFA的13C的自然偏移程度调查后发现，40%—90%的微生物碳源在作物变化后发生了改变，微生物更多的利用新植被作为碳源。而由于野外土壤生态系统中植被演替时间尺度较大，生物标志物的13C自然丰度示踪受限于其比较窄的变化范围（Faure，1978），必然不能对微生物量碳动态予以很好的指示变化。相反的，土壤PLFA单体的14C的自然丰度分布特征，可以表征长时间尺度以及在大范围空间内比较微生物新老碳源，并在平衡态生态系统中估算不同微生物量碳的周转速率（Yevdokimov et al.，2013）。如同样在 C3—C4植被演替系统的研究中，Kramer et al.（2006）对土壤微生物单体PLFA的测定不仅发现植被更替后微生物在植物碳源利用中的转变，还发现微生物对变化尺度较大的土壤有机碳中新碳的利用率为0—40%。此外，格兰仕阳性菌与阴性菌对植物碳和土壤碳的优先利用状态相反。目前，利用PLFA单体14C的自然丰度指示土壤微生物量碳动态的研究在国内外还未普及，主要由于单体 PLFA的14C测定所需苛刻的前处理技术和加速器质谱高昂的测定费用限制所导致。从个别已有的利用单体PLFA的14C自然丰度分析在土壤生态系统中开展的研究来看，对大尺度时间范围内的微生物量碳动态的监测（Kramer et al.，2010）以及在大空间范围内极端生态环境中微生物量碳动态的比较（Rethemeyer et al.，2005）都已经得到了很好的应用。利用单体PLFA的14C自然丰度分析，可以对自然环境中影响微生物量碳代谢的影响因素进行佐证，如土壤的冻结状态所影响的表层微生物量输入、微生物活性等（Hagedorn et al.，2019）；也可以探索不同生态系统中微生物量碳的碳源，如微生物是可以利用浅层沉积基岩中相对老的碳源等（Schwab et al.，2019）。

4 结语

碳同位素自然丰度分析是随仪器分析技术的进步，顺应人类历史发展造就环境优势所发展起来的新技术，将成为土壤生态系统中碳动态研究的有利工具。近年来随着大气中过量的核爆14C的浓度的下降，14C自然丰度在生态系统中作为几十年尺度时间范围内碳源的天然示踪因子会逐渐失效，应抓住机遇尽早开展研究。目前已有的应用碳同位素自然丰度分析对土壤碳动态的研究仍停留在局部地区，且主要针对表层10 cm左右的土壤，深层土壤有机碳的14C数据仍严重缺乏（He et al.，2016）。因此，未来研究中应利用碳同位素自然丰度在环境变化中指示灵敏的优势，在大尺度时间和空间范围内开展土壤碳动态的研究，尤其是针对认识缺乏的深层土壤碳动态开展长期生态学实验研究。