胎盘间充质干细胞治疗卵巢早衰的机制

杨稍稍，王焱，申倩倩，杨雪，王香香

(1.河南科技大学临床医学院，河南 洛阳 471000；2.河南科技大学第一附属医院妇产科，河南 洛阳 471003)

卵巢早衰是一种因卵巢功能减退引发的生殖系统内分泌疾病，其特征为血清雌激素水平下降、促性腺激素水平升高，多发生于女性初潮以后至40岁前。近年来卵巢早衰的发病率呈逐年升高趋势，在15～29岁、30～40岁女性中的发病率分别为0.1%、1%～3%[1-2]，其不同程度地影响了患者的身心健康。目前超过50%的卵巢早衰患者的病因不明，其发生主要与自身免疫功能、代谢紊乱、遗传和抗肿瘤治疗等相关[3-4]。针对这些病因，对卵巢早衰进行早干预、早治疗非常重要。目前临床上的治疗大多以改善症状为主，治标不治本，并未真正从根本上解决卵巢功能受损的问题，且远期并发症也较多。

随着干细胞治疗的兴起，尤其是对胎盘干细胞研究的深入，给多种难治性疾病的治疗带来希望。胎盘间充质干细胞(placental mesenchymal stem cells，PMSC)是一种多能干细胞，不仅具有较强的增殖能力和多向分化潜能，还具有独特的低免疫原性的特点。PMSC取材广泛便利，不具有侵袭性，病毒转染率低，无社会伦理争议，因此得到了广泛而深入的研究。目前，PMSC已广泛用于自身免疫性或化疗性卵巢早衰动物模型的研究，用以改善受损的卵巢功能。现就PMSC在自身免疫性和化疗药物引起的卵巢早衰中的研究进展进行阐述，以期为卵巢早衰的治疗提供新思路。

1 PMSC与自身免疫性卵巢早衰

据报道，10%～30%的卵巢早衰可能有自身免疫机制的参与，通过体液免疫、细胞免疫攻击卵巢组织，导致卵巢萎缩或卵泡衰竭[5-6]。Ebrahimi和Akbari Asbagh[7]研究显示，卵巢早衰的病因与颗粒细胞的凋亡密切相关。卵巢内各级卵泡的发育依赖于颗粒细胞的增殖和分化，颗粒细胞能够分泌类固醇激素和影响卵泡发育、闭锁的细胞因子，如转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β、γ干扰素、表皮生长因子等。颗粒细胞的凋亡可能导致卵泡数量减少，雌激素水平降低，最终导致卵巢早衰[8]。有研究表明，PMSC植入卵巢受损区域后可调控多种信号通路，分泌多种细胞因子，调节免疫功能[9-10]，抑制颗粒细胞凋亡，减慢卵泡闭锁过程，促进卵泡发育，改善卵巢组织内微环境，恢复卵巢的内分泌功能和排卵功能，提高生育能力[11]。PMSC治疗卵巢早衰可能与调控颗粒细胞的凋亡有关。

1.1PMSC通过免疫调节调控颗粒细胞的凋亡 自身免疫性卵巢早衰患者体内可能存在抗卵巢自身抗体，这些抗体与抗原结合后在补体的协同作用下产生细胞毒性作用，加速卵巢衰竭过程，导致卵巢早衰[12]。透明带是自身免疫性卵巢早衰患者体内重要的抗原决定簇，其中抗透明带抗体能够影响透明带功能，继而影响卵泡发育，导致卵巢早衰患者不孕。Zhang等[13]研究报道，PMSC移植可明显改善透明带糖蛋白3诱导的卵巢早衰小鼠体内的激素水平，提高卵巢储备能力。这可能因为PMSC分泌多种细胞因子，通过TGF-β/Smad信号通路减少窦前卵泡和囊状卵泡中颗粒细胞的凋亡，上调抗苗勒管激素的表达，抑制原始卵泡募集，减少原始卵泡消耗，提高卵巢储备能力，从而恢复卵巢早衰患者的卵巢功能。

谢江燕等[14]研究发现，卵巢早衰患者外周血中调节性T细胞(regulatory T cell,Treg细胞)数量减少、TGF-β1的水平降低，γ干扰素水平升高，说明卵巢早衰可能与Treg细胞、TGF-β1、γ干扰素相关。TGF-β在卵巢功能的调节中发挥着至关重要的作用[15]，TGF-β1参与了颗粒细胞的增殖、卵母细胞成熟及类固醇激素生成，而γ干扰素可以启动卵泡闭锁过程，刺激颗粒细胞中主要组织相容性复合体Ⅰ和主要组织相容性复合体Ⅱ表达，导致卵泡破坏，过高水平的γ干扰素会抑制排卵[16]。Yin等[17]研究发现，PMSC可上调卵巢早衰小鼠血清TGF-β水平，降低γ干扰素水平，促进Treg细胞增殖，减少颗粒细胞凋亡，恢复卵巢功能。该研究认为，PMSC移植后能够降低血清γ干扰素的水平，明显阻断卵泡闭锁、破坏，减少各级卵泡中颗粒细胞的凋亡；PMSC通过分泌TGF-β，不仅在卵泡生成早期阶段发挥刺激作用、调节原始卵泡池，还能刺激Treg细胞增殖，减少颗粒细胞凋亡[17]。这可能是PMSC通过免疫调节调控颗粒细胞凋亡治疗自身免疫性卵巢早衰的主要机制之一。

1.2PMSC通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路调控颗粒细胞凋亡 PI3K/Akt是细胞内重要的信号转导通路。在卵泡发育及排卵过程中，PI3K/Akt信号通路起着举足轻重的作用[18]，能够调节卵母细胞生长、原始卵泡发育以及颗粒细胞增殖和分化,是细胞增殖和凋亡过程中最主要的信号转导通路之一[19]。若PI3K/Akt信号通路异常，可能会导致原始卵泡发育缺陷,引起卵巢早衰。PI3K/Akt信号通路在自身免疫过程中发挥重要作用[20]。杨静和梁嘉丽[21]研究证实，卵巢早衰与PI3K/Akt信号通路密切相关，如果终止PI3K/Akt信号通路会导致原始卵泡过早发育,凋亡加速,最终导致卵巢早衰。马会明等[22]研究指出，颗粒细胞分泌的表皮生长因子能够刺激Akt，激活PI3K/Akt信号通路，抑制细胞凋亡，促进颗粒细胞增殖并持续分泌表皮生长因子，这种循环调节能够促进卵巢功能的恢复。Yin等[23]研究发现，与PMSC移植小鼠相比，在透明带糖蛋白3诱导的自身免疫性卵巢早衰小鼠中，使用LY294002阻断剂阻断PI3K/Akt途径后，抗苗勒管激素和雌二醇的水平降低，卵泡雌激素、促黄体生成素和抗透明带抗体的水平升高，卵巢组织中功能性卵泡数量明显减少，颗粒细胞增殖减少、凋亡增加。以上研究表明，PI3K/Akt信号通路在PMSC移植小鼠卵巢功能的恢复中起重要作用。此外研究还发现，当LY294002阻断PI3K/Akt通路后，小鼠中辅助性T细胞(helper T cell,Th细胞)/细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell,Tc细胞)比例显著增加，Treg细胞减少，Th17/Treg细胞失衡，不能维持正常状态下的免疫平衡，导致自身免疫的低耐受性和卵巢早衰进展[23]。PMSC的植入可能会影响免疫细胞并促进卵巢功能恢复，其机制可能为：PMSC移植后，激活PI3K/Akt信号通路，减少卵巢早衰小鼠卵巢中颗粒细胞的凋亡，降低Th17/Tc17细胞和Th17/Treg细胞的比例，从而改善卵巢功能。

1.3PMSC通过抑制肌醇需求酶(inositol-requiring enzyme，IRE)1α信号通路调控颗粒细胞凋亡 内质网应激是诱导细胞凋亡的信号转导途径之一[24]，参与卵巢功能的异常调节[25]。内质网是加工和合成细胞蛋白的重要细胞器，可维持细胞内环境的稳定。研究表明，颗粒细胞的正常生理功能取决于内质网中Ca2+储存的稳态平衡[26]。一旦发生内质网应激，将会聚集大量未折叠或错误折叠的蛋白质，Ca2+稳态失衡，细胞内环境稳态遭到破坏。此外内质网应激期间，胱天蛋白酶(caspase)12激活后调控颗粒细胞的凋亡。

IRE1蛋白是一个定位于内质网上的丝氨酸/苏氨酸激酶/核酸内切酶，是内质网应激信号中最为保守的感应蛋白。IRE1α是一种能够调节细胞命运的内质网跨膜传感器，能启动转录因子X-box结合蛋白1以调节内质网应激反应基因(如葡萄糖调节蛋白78)，通过减少未折叠或错误折叠蛋白恢复细胞稳态[27]。IRE1α过度激活，可通过激活下游信号分子增强子结合蛋白同源蛋白减弱自身免疫耐受性并诱导细胞凋亡[28]。增强子结合蛋白同源蛋白作为雌激素受体诱导细胞凋亡的重要介质，能够增加凋亡诱导底物BIM的表达，同时减少B细胞淋巴瘤/白血病-2的表达[29]。Li等[30]研究发现，卵巢早衰小鼠卵巢组织中caspase-12的表达显著增加，PMSC移植后，卵巢中IRE1α、X盒结合蛋白1、葡萄糖调节蛋白78以及caspase-12蛋白的表达被显著抑制，从而导致颗粒细胞凋亡减少。以上研究表明，内质网应激相关的IRE1α信号通路在卵巢颗粒细胞凋亡中发挥重要作用。

2 PMSC与化疗性卵巢早衰

目前关于化疗性卵巢早衰的相关机制尚未阐明。研究认为，化疗药物导致的卵巢早衰可能与细胞内线粒体氧化应激及卵巢周围组织血供密切相关[31]。PMSC移植入卵巢受损区域后，可通过某种信号通路、细胞因子、基因调控来改善线粒体功能，恢复受损卵巢组织血供，改善卵巢功能。

2.1PMSC与线粒体氧化应激 线粒体是颗粒细胞和卵母细胞中含量最丰富的细胞器。佟超[32]研究发现，线粒体异常是引起卵巢早衰的关键。活性氧类(reactive oxygen species,ROS)是线粒体的代谢产物之一，细胞内ROS水平及其合成速度对线粒体的代谢和生长至关重要[33]。Lin等[34]报道，铜锌超氧化物歧化酶1通过调控细胞内超氧阴离子自由基和过氧化氢的稳态平衡，清除细胞内多余的ROS。Dando等[35]研究发现，线粒体膜上的解偶联蛋白-2发挥着调节线粒体膜电位和ROS生成的作用。在相丽等[36]的研究中，环磷酰胺处理的卵巢早衰大鼠体内会产生大量的ROS，进而产生氧化应激反应，导致细胞线粒体功能受损，并诱发DNA/RNA损伤，引起卵巢组织内ROS和8-羟基脱氧鸟苷水平显著升高，这种DNA改变与氧化应激间的恶性循环引起线粒体功能进一步减退，导致细胞内能量代谢降低有关。PMSC移植后可明显降低环磷酰胺卵巢早衰大鼠体内解偶联蛋白-2、超氧化物歧化酶1、ROS、8-羟基脱氧鸟苷的水平，改善线粒体功能，抑制氧化应激，从而降低化疗药物对卵巢功能损伤的程度。该研究认为，PMSC治疗化疗性卵巢早衰的机制可能为解偶联蛋白-2通过解偶联作用使线粒体膜电位发生变化，控制线粒体ROS的合成，降低氧化应激对线粒体的损伤，最终保护卵巢线粒体的结构和功能[36]。

2.2PMSC通过介导沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，SIRT1)/过氧化物酶体增殖物活化受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α,PGC1α)/核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2 related factor 2，Nrf2)信号通路 SIRT1是哺乳动物SIRT2超蛋白家族成员之一，定位于细胞核内，可通过调节多种底物的去乙酰化参与氧化应激、衰老以及凋亡等多种生物学过程，参与多种疾病的发生发展[37]。研究表明，SIRT1的高表达能够防止氧化应激对卵巢组织的损伤[38]。PGC1α是SIRT1的下游分子，当组织受到氧化应激损伤时，SIRT1的活性、PGC1α去乙酰化受到影响，机体组织的代谢发生障碍[39]。为防止氧化应激引起的不可逆损伤，需要细胞中的多种抗氧化系统的调节，其中Nrf2在细胞的抗氧化应激中起关键作用。正常情况下，Nrf2处于抑制状态，一旦发生氧化应激，Nrf2通路被激活[39-40]，然后发生一系列抗氧化反应，降低氧化应激对机体组织的损伤[41-43]。侯巧妮等[44]的研究表明，PMSC移植后，化疗药物诱导的卵巢早衰小鼠中SIRT1和PGC1-α的表达及Nrf2核转位增加。该研究认为，PMSC迁移至卵巢受损区域后通过激活卵巢组织中的SIRT1/PGC1α/Nrf2信号通路，保护机体免受氧化应激损伤，改善激素水平，提高卵巢储备能力，降低卵巢组织纤维化水平，从而恢复卵巢功能[44]。

2.3PMSC介导Bcl-2/Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)基因调控颗粒细胞凋亡 线粒体凋亡途径主要受Bcl-2家族蛋白的调节,Bcl-2蛋白具有促进细胞生存，抑制细胞凋亡的作用，而Bax基因是Bcl-2基因家族的一员，其作用与Bcl-2相反，活化后能够破坏线粒体膜的通透性，加速细胞凋亡。张纯等[45]研究发现，Bcl-2/Bax的比值与卵巢颗粒细胞的凋亡相关，若Bcl-2蛋白含量降低，Bcl-2/Bax比值下降，细胞内线粒体的通透性增加，促使线粒体中细胞色素C和其他蛋白释放，启动一系列caspase凋亡级联反应，促进颗粒细胞凋亡，反之抑制颗粒细胞凋亡。此外，PI3K/Akt信号通路激活后也可调节Bcl-2家族成员的活性,产生凋亡或抗凋亡的结果。杨阳等[46]研究发现，当内质网发生应激时，大量未折叠/错误折叠的蛋白质聚集，Ca2+超载或稳态失衡，一方面启动caspase凋亡级联反应；另一方面诱导Bax激活，下调Bcl-2蛋白的表达，促进凋亡发生。李永丽等[47]研究发现，卵巢早衰大鼠移植PMSC后，Bcl-2蛋白的表达增加，阻止线粒体细胞色素C释放，抑制颗粒细胞凋亡，从而修复遭到破坏的各级卵泡，恢复卵巢组织结构，改善卵巢功能。

3 小 结

目前PMSC治疗卵巢早衰虽然只在动物模型中成功，但仍给卵巢早衰患者带来了希望。PMSC可通过PI3K/Akt信号通路调节免疫细胞，抑制颗粒细胞凋亡，改善卵巢组织微环境；也可通过抑制内质网应激中的IRE1α信号通路调控一系列细胞因子的表达，抑制颗粒细胞凋亡，从而治疗自身免疫性卵巢早衰。对于化疗性早衰，PMSC可能是通过SIRT1/PGC1α/Nrf2信号通路降低颗粒细胞和卵母细胞中的线粒体氧化应激反应，改善线粒体功能，从而改善卵巢功能；也可能通过调控Bcl-2/Bax比值改变线粒体膜通透性来调控颗粒细胞的凋亡，进而发挥治疗卵巢早衰的作用。无论是自身免疫性还是化疗性卵巢早衰，PMSC移植后可能通过相同的信号通路或线粒体途径调控颗粒细胞的凋亡，使受损的卵巢功能恢复，这为临床治疗卵巢早衰提供了新思路，但目前仍需进行大量的临床试验进一步探讨PMSC治疗人卵巢早衰的可能性。