结直肠癌肝转移小鼠模型建立及应用现状

向彦臻，陈欢，殷佩浩，2a，徐可，2b ，詹月萍，2b

(1.成都中医药大学上海普陀教学基地，上海 200062； 2.上海中医药大学附属普陀医院 a.普外科，b.中西医结合肿瘤介入研究所，上海 200062)

结直肠癌是美国第三大最常见癌症[1],也是中国最常见的恶性肿瘤之一。在全球确诊的136万例结直肠癌中,中国结直肠癌的新发病例达25.3万例，是全球结直肠癌每年新发病例数最多的国家[2]。对于结肠癌患者，即使在早期切除原发病灶也仍有可能发生转移,最终导致患者死亡。肝脏是结直肠癌转移最常见的部位，常经门脉循环行血源性传播[3]。

结直肠癌肝转移的生物学过程极为复杂，是由多因素调控、多步骤构成的过程，其具体机制目前仍不明确。肝转移的过程可分为几个连续步骤。首先，原发肿瘤灶中的癌细胞分泌血管生成因子导致血管扩张，经激活蛋白酶的局部作用，癌细胞进入薄壁静脉血管和淋巴管，从而进入血液循环，大多数循环癌细胞在此过程中受到免疫系统和血流剪切力的攻击而破坏，存活的癌细胞或团块形成栓塞阻塞远处器官毛细血管床，最终癌细胞向肝实质外渗并形成微转移灶[4]。

深入研究结直肠癌肝转移的具体机制以及探索有效的抗转移治疗方法，需要建立人结直肠癌肝转移动物模型。根据成瘤机制，结直肠癌小鼠造模方法主要分为致癌剂诱发小鼠成瘤法、基因工程小鼠成瘤法及直接种植肿瘤细胞或组织成瘤法。致癌剂诱发法耗时长、变异大、组间不易获得病程及癌块相似的小鼠。基因工程法成瘤率和转移率低，实验周期长。故前两种造模法极少用于结直肠癌肝转移的造模。现就结直肠癌肝转移常用的直接种植法造模及应用情况予以综述。

1 盲肠种植法

盲肠种植法是开腹后将结直肠癌肿瘤细胞或组织直接移植于盲肠浆膜下所产生的结直肠癌肝转移模型，此法为原位种植形成的自发性肝转移模型，能较为客观地模拟人类结直肠癌细胞的淋巴道转移和血运播散，较好地体现结直肠癌的生物学特性。

与肿瘤组织移植法相比，细胞注射法流程简便、操作易行，且更为常用，建模成功的关键在于所选肿瘤细胞的侵袭能力和肿瘤细胞的数量。为证明微RNA(microRNA，miR)-192的表达能抑制体内结直肠癌细胞向肝转移，Geng等[5]将绿色荧光蛋白标记的表达miR-192的2×106个HCT116细胞直接注射到4～5周裸鼠的盲肠。4～5周处死裸鼠，切除盲肠及肝脏进行评估发现，对照组肝转移发生率为53%，而miR-192表达组肝转移的发生率低至8%。Limani等[6]将MC-38结肠癌细胞注射至C57B1/6小鼠的盲肠壁，用肌醇三焦磷酸酯和FOLFOX(叶酸、氟尿嘧啶、奥沙利铂)处理小鼠，6周后评估小鼠肝转移指标，结果显示，肌醇三焦磷酸酯较FOLFOX抗结肠癌肝转移作用更明显。为证实在肝转移和源于远处转移的结直肠癌细胞系中miR-885-5P的表达上调，Lam等[7]将1×106个HCT116细胞原位注射于6～8周的NOD/SCID小鼠的盲肠壁，观察肿瘤转移及miR-885-5P的表达情况。细胞注射虽然相对简便，但接种后的肿瘤细胞易从浆膜中漏出。Zhang 等[8]在建模时做了进一步改善，将含有2×106个结肠癌细胞的10～15 mL磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)用33号微注射器注入野生型C57BL/6和白细胞介素-33(interleukin-33，IL-33)敲除小鼠的盲肠浆膜下，注射部位用组织胶密封、70%的乙醇和PBS清洗，以防止渗漏。6周后处死小鼠，收集并评估自发性肝转移肿瘤组织。结果表明，在结肠癌细胞中IL-33的表达增加了肿瘤的发生和肝转移。

肿瘤组织移植是将结直肠癌细胞先注射于动物皮下或其他部位，待形成肿瘤块后再移植到盲肠的方法。由于此法与临床结直肠癌肝转移的突破方式和时间更为接近，因而认为其形成肝转移的可信度更高。但此种方式的手术要求高、过程复杂，且耗时较长。Tao等[9]将2×107个HCT116细胞注射至裸鼠的右腋窝，3周后用无菌技术切除肿瘤并切至1～2 mm3大小，将切下的肿瘤块移植至48只裸鼠的盲肠中，7 d后随机分为4组给药，即对照组、胃肠安组、5-氟尿嘧啶组、胃肠安+5-氟尿嘧啶组，7周后处死裸鼠并收集原位肿瘤、肝转移瘤及肿瘤邻近组织，检查结果显示，与对照组相比，胃肠安+5-氟尿嘧啶组和胃肠安组肝转移更少。Agarwal等[10]将非靶向短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)、蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt) shRNA2或Akt2 shRNA2转染的绿色荧光标记的7×106个GEO细胞注射到雄性裸鼠的背侧皮下,形成异种移植物后切除肿瘤并切成1 mm3的碎片，将两块碎片植入另一只裸鼠的盲肠。采用×7倍放大和显微外科技术，用8-0尼龙缝合线将异种移植物缝入浆膜下两个不同位置。由于手术的复杂性，术后每组25只小鼠只有17～22只存活，9周后处死小鼠评估肝转移，结果表明，Akt2缺失抑制体内结直肠癌转移。Yang等[11]将2×106个Lovo-Luc细胞悬浮于F12K培养基中，再将0.2 mL悬浮液皮下接种于BALB/c裸鼠的右前肢。当肿瘤生长到约1 cm3时取出皮下肿瘤浸入含有青霉素和链霉素的F12K培养基中，肿瘤组织切块备用。另取裸鼠，在盲肠血供充足处插入备用肿瘤块，无菌纱布吸取周围液体，肿瘤表面涂上适量的医用OB胶，确保肿瘤扩散至盲肠壁，静置45 s胶凝固后回纳盲肠并关腹，术后7 d开始接受药物处理3周，最后评估裸鼠肝转移情况。

2 脾脏种植法

经脾脏建立结直肠癌肝转移模型是最常用的方式，可分为脾脏保留法和去脾法。虽与盲肠种植法相比，其不能客观模拟结直肠癌肝转移的宏观过程,但脾脏种植法可用于筛选高转移倾向的恶性结直肠癌细胞、研究肿瘤免疫疗法、开发抗转移药物等。

保脾法是一种易于实施且重复性好的用于建立结直肠癌肝转移模型的方法。脾脏是机体的免疫器官，肿瘤细胞经过脾脏免疫细胞后转移至肝脏更符合体内肿瘤转移过程。此法注射肿瘤细胞时需谨防细胞溢出而造成腹膜内肿瘤。Zhou等[12]将1×106个SW480或SW620细胞悬浮在50 μL PBS中，注入脾远端，6周后处死小鼠，切除脾脏和肝脏，结果发现，酸离子通道2过表达促进SW480细胞的肝转移，其敲除将减少SW620细胞的肝脏转移。Zhang等[13]将5×105个HCT116细胞注射至BALB/c裸鼠脾脏后，分别用小檗碱和0.9%氯化钠(对照组)灌肠4周，实验结束处死裸鼠，收集裸鼠肝脏发现，与对照组相比，小檗碱组肝转移灶的体积明显较小、数量较少。

脾脏切除法所建模型可以避免保脾法形成的脾脏原位肿瘤对小鼠的影响，能较好地模拟结直肠癌肝转移血行转移过程，形成的肝转移灶集中而明显。但切除脾脏易致实验小鼠死亡，因此此法对实验要求较高。Shimizu等[14]麻醉小鼠后，在靠近脾脏左侧处行0.5 cm切口，用27 G针头将含有2.0×106个CMT-93结直肠癌细胞的200 μL PBS分别缓慢注射至野生型和血管紧张素Ⅱ亚型受体1α敲除小鼠的脾脏，5 min后取脾关腹，2周后处死小鼠，取出肝脏，与野生型相比，血管紧张素Ⅱ亚型受体1α敲除小鼠肝脏的重量及肝转移率明显降低。Zhang等[15]为获得体内高转移性结肠癌细胞，将含有1×105个MC38细胞的100 μL PBS注射至C57BL/6小鼠脾脏，5 min后去脾，3周后获得肝转移瘤，用胶原酶处理获得肝转移瘤细胞，从而提取出单个无菌细胞，选出的细胞再用G418(400 μg/mL)处理至少1周后再次注射至小鼠脾脏，重复9个循环以获得高侵袭性的MC38-LM10细胞。Tohme等[16]建立缺血再灌注模型，在再灌注时，用27 G针头将 5×104个MC38细胞注射至小鼠脾脏，与此同时小鼠接受聚环氧乙烷或聚乙二醇处理，肿瘤细胞注射10 min后去脾，评估聚环氧乙烷是否能抑制肝转移灶的生长。结果显示，聚环氧乙烷能减少肝缺血再灌注后新肝转移瘤的形成。

考虑到保脾法所形成的肝转移瘤不佳及切脾法对动物自身免疫系统的破坏，在某些实验中常运用脾脏半切除法，此法可兼顾保脾法和切脾法的优点，又能减少两者对小鼠的伤害。Rahbari等[17]为模拟结直肠癌肝转移，将脾脏分成两个部分，将1×105个CT26细胞注射到远端脾尾部，然后切除注射的脾半球，其余半球保持在原来位置。为评估肿瘤负荷，他们将小鼠随机分组，并在出现肉眼可见的肝转移瘤后(注射后8～12 d)开始治疗。Chen等[18]将小鼠分为SW620-血管内皮样蛋白1组和SW620-对照组，麻醉后暴露脾脏，脾脏分为两半后分别被夹住，将2×106个结直肠癌细胞经其中一个半脾的血管注入，经PBS冲洗后切断引流半脾的脾血管，并切除注入肿瘤细胞的半脾，逐层关腹，监测肝转移情况，2个月后对肝转移瘤进行组织学分析。结果发现，SW620-血管内皮样蛋白1组的肝转移率低于SW620-对照组。

3 肝脏直接种植法

肝脏直接种植法是将结直肠癌细胞或瘤块直接接种到肝脏所形成的结直肠癌肝转移灶。肝脏直接种植法虽不能客观模拟肿瘤细胞的生长、侵袭及转移的全过程，但成瘤率高，且成瘤速度快，更适合于晚期结直肠癌肝转移的研究。

肝脏直接种植法中的细胞注射法具有简单易行、重复性好的特点。Sun等[19]为证明胰岛素诱导基因2与结肠癌晚期的关系，在小鼠肝脏右下叶注射胰岛素诱导基因2 shRNA或荧光素酶shRNA转染稳定的HT29细胞,在第28天处死小鼠后计算肝左叶的转移结节数，结果发现，稳定的胰岛素诱导基因2 shRNA 转染HT29细胞可显著抑制非移植肝叶中肝肿瘤结节的形成。细胞注射法中非常关键的一点是防止肿瘤细胞外渗，Fries等[20]对此做了进一步改善，沿腹中线打开腹壁后，用27 G针头的结核菌素注射器将含有5×105个结肠癌细胞的悬液注射到左肝叶。为了防止肿瘤细胞溢出和出血，压迫注射部位5 min，随后关腹。Chou等[21]证明，Scellin在肝转移性结肠癌细胞系中特异性表达，将结肠癌细胞对照组和Scellin敲除的结肠癌细胞组分别与基质凝胶混合，向5周龄的雄性BALB/c裸鼠肝内注射(1×105个/50 μL)，监测肿瘤生长，8周后处死小鼠并检测肝转移瘤的生长情况，结果发现，Scellin的敲除增加了结肠癌的迁移和侵袭。Vasquez等[22]将5×105个MC38细胞注射到6～8周的C57BL/6雄鼠的肝左叶，建立结直肠癌肝转移模型，用两种不同剂量的编码α干扰素的腺相关病毒(adeno-associated virus encoding interferon α，AAV-IFNα)处理小鼠: 1×1010AAV-IFNα、5×1011AAV-IFNα、AAV-荧光素，21 d后测量肿瘤体积发现，AAV-荧光素组和低剂量AVV-IFNα组小鼠出现了肿瘤，而接受最高剂量的AVV-IFNα小鼠未出现肿瘤。

在部分实验中，考虑到肝转移建模的成功率及针对性研究，往往会将肿瘤细胞先注射于小鼠各部位形成肿瘤块后，再将肿瘤块植入研究小鼠的肝脏。Murakami等[23]将5×105个绿色荧光蛋白标记的HT29细胞注射至小鼠脾脏上、下极，3周后获得肝转移瘤，将形成的肿瘤块切至8 mm3小块备用，另取裸鼠暴露其肝脏左叶，将切下的备用肿瘤碎片3 mm3植入肝脏左叶，回纳肝左叶并关腹，从而获得原位肝转移模型。Hiroshima等[24]将5×105个绿色荧光蛋白标记的HT-29细胞在无血清介质中清洗2遍后注射到4～5周的胸腺裸鼠脾脏，4周形成多叶肝转移灶后处死裸鼠，获得结肠癌肝转移肿块，另取裸鼠在其肝脏左叶下植入3 mm3先前切下的肿瘤碎片，3周形成单侧转移肿瘤。Sánchez-Velázquez等[25]用转移性较差的KM12C人结肠癌细胞株皮下植入供体裸鼠体内生长，之后取出形成的肿瘤并切割至2 mm3大小的肿瘤碎片备用，将备用肿瘤碎片植入另一只裸鼠的肝包膜内侧并缝合，15 d后结肠癌肝转移瘤长到适合手术大小，对裸鼠施以不同电压(2 000 V/cm、1 000 V/cm)的不可逆电泳化，以确定高电泳不可逆化处理裸鼠是否能延长生存期，以及肿瘤组织学是否发生改变。

4 门静脉种植法

门静脉种植法是经门静脉系统注射结直肠癌细胞，经过血行转运至肝脏而形成的结直肠癌肝转移肿瘤的方法。虽此法不能客观模拟转移瘤转移的临床特征，但门静脉易显露，操作较容易，肿瘤形成速度快，形成率高，是较好的研究晚期结肠癌肝转移的方法。Kee等[26]为研究CXC趋化因子配体16对大肠癌肝转移的影响，在C57BL/6小鼠门静脉注射了SL4(对照组)和SL4CXC趋化因子配体16(细胞组，7.5×104个细胞/200 μL PBS)，17 d后处死小鼠并评估肝转移情况，结果显示，肿瘤源性CXC趋化因子配体16的表达抑制了肝转移。Hashimoto等[27]通过门静脉将结肠癌细胞注射到12周的NOD/Jic雄性小鼠肝脏，分别在4组小鼠的门静脉中植入SW480干扰细胞、SW480 Sh-Prune(h-prune敲低的SW480)、HCT116对照细胞和HCT116 Prune(h-prune表达的HCT116)细胞。每周通过体内成像记录肿瘤的生长情况，4周后评估肝转移情况。结果提示，h-prune与肿瘤侵袭和远处转移相关。

Wu等[28]为确定asporin在结直肠癌肝转移中的作用，将数量相等的RKO/NC、RKO/sh1-asporin、HT-29/Vector和HT-29/asporin细胞注入BALB/c裸鼠的门静脉，6周后取出肝脏进行分析，结果显示,与HT-29/Vector组相比，HT-29/asporin细胞组肝转移明显增加，而与RKO/NC相比，RKO/sh1-asporin组的肝转移瘤明显减少。Bocuk等[29]暴露C57BL/6NCrl雄鼠门静脉，用30 G针头向门静脉内注射10 μL含有1×107个CMT-93细胞的PBS缓冲液，4周后处死小鼠并取出肝脏分析转移情况。Becker等[30]认为，肝脏核磁共振能预测小鼠结肠癌肝转移，在麻醉小鼠腹部行3 cm切口暴露门静脉，将1×105个MC38细胞注入8只雄鼠的门静脉内，另取2只雄鼠注射缓冲溶液作为对照，注射后的第4、8、12、16和20天采用 T2加权自旋回波序列行小型动物磁共振成像,20 d后磁共振成像显示出现肿瘤。Tauriello等[31]在BALB/c nu/nu小鼠7周时，使用30G注射器向门静脉内直接注射100 μL结肠癌肿瘤细胞悬浮液以构造结肠癌肝转移模型。

5 小 结

结直肠癌肝转移的过程十分复杂，小鼠建模方式的选择需根据具体的实验要求及实验条件决定。除上述4种常用建模方式外，皮下种植法、尾静脉种植法、腋窝种植法及腹膜种植法等也是常用的结直肠癌小鼠造模方式，但这些方法因难以表现出恶性结直肠癌细胞向肝脏浸润和转移的特性，而不易构建出结直肠癌肝转移模型。目前，尚未有一种小鼠模型能与人类结直肠癌肝转移的发生发展完全契合，因此需致力于构建新的更便捷、更贴近人类肿瘤发展进程的动物模型，为揭示结直肠癌发病、转移机制及探索治疗措施提供有效手段。