鸡安卡拉病蜂胶自家苗的制备

王欣宇 穆国冬 张 莹 贾淇元 任 锐*

1.吉林省畜牧兽医科学研究院，长春130062；2.吉林省动物疫病控制中心，长春130062；3.吉林省白城市畜牧总站，吉林白城137000

鸡心包积液－肝炎综合症是由I 群腺病毒Fav-4 型引起的一种传染病，肉鸡和蛋鸡皆可感染，鸡感染死亡可出现心包黄色积液，肝脏肿大并出现大量坏死的肝细胞。此病经常与禽白血病等疾病混合感染，混合感染死亡率可达30%，严重时可达80%～90%，已经成为危害我国禽类养殖业的重要疾病之一。

1 材料与设备

1.1 仪器设备

组织搅拌机、灭菌解剖刀、解剖剪刀、剪钳、镊子、酒精灯、托盘、37 ℃恒温培养箱、漏斗、灭菌3层纱布、烧杯、量筒、搅拌棒、匀浆机、250 mL 和500 mL 灭菌疫苗瓶、移液器。

1.2 材 料

病死鸡心脏及包膜、肝脏组织、蒸馏水、生理盐水、3‰甲醛、双抗（青霉素、环丙沙星），蜂胶，Tween-80，75%酒精。

2 自家苗的制作

2.1 组织处理

用灭菌解剖刀将肝脏组织切成小块，放入灭菌过的组织搅拌机中绞碎成肉糜状，倒入桶中按1:10的比例加入生理盐水混匀。密封后放进-20 ℃冰柜冷冻，完全冻结后再取出融化，重复上述过程，反复冻融3 次。

冻融3 次后将解冻后的病料生理盐水混悬液用3 层灭菌纱布过滤，弃去残渣，在滤液中加入3‰甲醛，充分搅拌混匀，装入适当容器内最后放入37 ℃恒温培养箱灭活48 h，每隔2～3 h 用搅拌棒充分搅匀1 次。灭活完成后用3 层灭菌纱布进行二次过滤，弃去滤渣，用移液器抽取1 mL 滤液用于无菌检查，玻璃棒均匀涂布普通肉汤培养基，放入37 ℃温箱培养18～24 h,观察有无菌落生长。剩余滤液中按1 000 UI/mL 加入双抗（环丙沙星、青霉素），充分摇匀，放入4 ℃冰箱中冷却备用。

2.2 蜂胶提纯

取蜂胶块敲打研磨粉碎，称取重量，按比例加入95%乙醇，根据室温静置24～72 h，低速离心取上清液，得到蜂胶乙醇浸液。取1 平皿，内置1 张圆形滤纸，滤纸可折叠成风琴状以加大与空气流通面积。用移液器取1 mL 蜂胶乙醇浸液滴在滤纸上，滤纸放置入干净平皿中，电子天平称量平皿和滤纸总重量，将平皿放入37 ℃烘箱过夜，待滤纸完全烘干恒重后，再次用电子天平称量平皿加滤纸重量，计算重量差，重量差即为每毫升蜂胶中干物质含量，算出蜂胶纯度，并计算浸出液中蜂胶干物质含量。再用95%乙醇配成含蜂胶干物质20 mg/mL 的浸液，4 ℃保存备用。

2.3 自家苗的配制

取2.1 步骤处理过的灭菌组织滤液500 mL，加入蜂胶浸液110 mL、Tween-80，倒入容积2 L 的匀浆机中，充分搅匀3～5 min，可分档间隔操作累计时长。室温静置，待表面泡沫消失后，根据实际需要分装装入500 mL 或250 mL 灭菌疫苗瓶，密闭封口后存于4 ℃待用，保质期一般不超过1 年。

3 无菌检测及安全检验

3.1 无菌检测

用移液器吸取疫苗成品，将疫苗分别接种于普通肉汤琼脂和麦康凯营养琼脂中各1 mL，灭菌玻璃棒均匀涂铺，培养箱37 ℃培养18～24 h，均无细菌生长，可证明甲醛灭活完全，无菌检测合格。

3.2 安全检验

选用30 日龄至60 日龄非免疫健康鸡10 只，每只皮下注射疫苗1 mL，同时设立同样日龄非免健康鸡空白对照组10 只，每只注射生理盐水1 mL。观察7～10 d ，两组鸡精神均正常，食欲良好，亦未见任何不良反应，随机剖检免疫组鸡注射部位及内脏均无任何肉眼可见的异常变化，对照组也健康无异常，表明疫苗安全。

4 结 果

该批疫苗完成安全试验后，紧急接种发病鸡场，全群免疫，每只鸡按体重肌肉注射1～1.5 mL蜂胶疫苗，疫苗接种后，增加鸡群日粮中的蛋白质和维生素含量，增加饮水量。5 d 后鸡群临床无新增病例且无新增死亡鸡，说明此批自家苗对此病发挥了显著作用，产生了较好的免疫防制效果。

5 讨 论

制作自家苗所选取的病料都来自于本养殖场的发病动物分离出的病料组织，病料组织经过绞碎灭活后制备的疫苗，其抗原成分全面，基本包含了能够引起本次疾病的病原，可以对动物进行全方位、多方面的诱导免疫保护。禽腺病毒在拥有多种血清型的情况下，各类商品疫苗均不能达到全面理想的免疫治疗效果，自家苗正好可以弥补禽腺病毒商品苗血清型单一覆盖不全的缺点，更好地提供应急免疫。

蜂胶属于天然来源佐剂，是蜜蜂在树干或绿植芽孢上采集树脂，将树脂处理后形成的具有芳香气味的固体物，蜂胶免疫佐剂作为一种广谱生物活性物质，具有良好的免疫增强作用，它能增强巨噬细胞的吞噬能力，促进抗体的产生，提高机体的特异性和非特异性免疫力。应用蜂胶或配合抗原引入机体，既能引起特异性免疫应答，又能启动非特异性防御机制，能刺激免疫机制和丙种球蛋白活性，增加抗体产量，增强补体活性和吞噬细胞的吞噬能力。蜂胶所含的成分极其复杂，有研究表明，蜂胶本身无明显抗原性和过敏性，毒副作用较小[1]。

蜂胶与抗原按比例混合接种于机体后，可以增强补体的功能，产生较多的抗体，提升血清抗体水平，是天然的免疫增效佐剂，并且具有抑菌性和更高的安全性。不同方法制备的蜂胶佐剂所产生的免疫效果也不尽相同，蜂胶佐剂的研究发展及应用也是适应疫苗的应用发展的，在兽医临床应用的蜂胶疫苗佐剂会随着养殖业的发展、养殖技术的发展而更广泛地应用到兽用疫苗当中。翟晓虎等[2]应用蜂胶黄酮作为PPV 灭活疫苗佐剂，可以提升豚鼠细胞免疫和早期体液免疫。

自家苗主要是针对个别养殖场的病原血清型而制造成的疫苗，在一定程度上可以起到很好的应急免疫作用，但也存在一定的缺点和应用范围制约，因此在自家苗的制作和使用上应该做到合理应用，规范应用，不随意扩大应用范围，起到快速治疗的辅助作用。