IGF1通过BMP2-Smad1/5信号通路调控犬上颌窦黏膜干细胞成骨分化

廖春晖， 李明飞， 叶金梅， 彭伟， 陈松龄

1.广州市妇女儿童医疗中心口腔正畸科，广东 广州（510000）； 2.中山大学附属第一医院口腔科，广东 广州（510080）

上颌后牙区骨量不足牙种植目前仍是种植领域的难题［1］。上颌窦底提升术是解决上颌后牙种植区骨量不足的常用的方法，其核心机制是窦底提升术后的空间成骨效应［2］。上颌窦黏膜在窦底提升术后不仅起到天然的生物屏障作用，同时因其本身具有成骨潜能的干细胞，在上颌窦底提升术后空间成骨扮演着重要的作用［3］。现有的研究多关注于上颌窦黏膜干细胞（maxillary sinus membrane stem cells，MSMSCs）的成骨能力，而对其核心的分子调控机制的研究甚少。为明确胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factor1，IGF1）参与调控MSMSCs 成骨分化的分子调控机制，本研究拟将构建的IGF1 基因表达重组腺病毒Ad-IGF1 感染上颌窦黏膜干细胞，通过Western blot、免疫组化染色观察在上颌窦黏膜干细胞分化过程中，BMPSmads 通路中重要信号蛋白骨形态形成蛋白2（bone morphogenetic protein2，BMP2）和Smad1/5 的磷酸化水平以及核转位变化情况；利用BMPSmads 通路抑制剂Noggin 和p38MAPK 的通路抑制剂SB203580 处理感染Ad-IGF1 的细胞，观察成骨标志物的表达变化；并观察抑制剂处理感染Ad-IGF1 的细胞后磷酸化Smad1 蛋白表达变化情况。本研究获得中山大学附属第一医院伦理委员会批准。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂

Beagle 犬（高要市康达实验动物科技有限公司），年龄1～2 周岁，体重15～20 kg。胎牛血清（Gibco，美国）；中性蛋白酶（Roche，美国）；Ⅱ型胶原酶（Gibco，美国）；α-MEM 基础培养基（武汉市博士德公司）；CD146 磁珠分选试剂盒（Macs，美国）；LipofectamineTM2000（Invitrogen，美 国）；Trizol Reagent（Invitrogen，美国）；DAB 试剂盒（Abcam，英国）；荧光定量PCR 检测试剂盒（Takara，日本）；兔抗犬Runx2、OPN、p-p38、p-Smad1/5、Smad1/5、BMP2多克隆抗体（Abcam，英国）；羊抗兔IgG-HRP（Abcam，英国）；图像Pro 5.0 分析系统（Media Cybernetics，美国）；茜素红（Thermo Fisher Scientific，美国）。

1.2 犬上颌窦黏膜干细胞的分离与培养

Beagle 犬上颌窦黏膜的取材按本课题组前期报道的方法去采集［3］。使用酶消化法进行细胞的原代培养，培养至70%～80%汇合时传代，按照1∶3 的比例进行传代扩增培养。按照CD146 磁珠分选试剂盒操作方法进行免疫磁珠法分选CD146 阳性细胞，简述如下：单细胞悬液中按4 μL/mL 加入小鼠抗犬CD146 免疫磁珠，混合均匀后置于4 ℃孵育30 min，PBS 润洗2 次，避免干燥。准备磁力架和磁柱，PBS 润洗2 次，把结合了磁珠的细胞悬液放入磁柱中，过柱，PBS 清洗混匀。并取样品滴于载玻片和细胞计数器上，分别进行细胞纯度分析和活力测定。用倒置相差显微镜观察细胞生长情况及细胞形态。

1.3 IGF1 基因表达重组腺病毒Ad-IGF1 载体构建

根据IGF1 基因序列，设计末端带NheI 和HindⅢ的酶切位点的特异性引物，将通过PCR 扩增的IGF1 基因序列克隆到PDC316-mCMV-ZsGreen 载体中，构建PDC316-mCMV-ZsGreen-IGF1 腺病毒载体（图1），即Ad-IGF1 载体。IGF1 引物扩增总长度为462 bp，引物序列设计如下。IGF1-NheI-F：5′-CTAGCTAGCACCATGGGAAAAATCAGCAGTCTTCC-3′；IGF1-HindⅢ-R：5′-CCAAGCTTCTACATTCTGTAGTTCTTGTTTCCTG-3′。

Figure 1 Map of PDC316-mCMV-ZsGreen-IGF1 vector图1 PDC316-mCMV-ZsGreen-IGF1 腺病毒载体示意图

1.3.1 PCR 扩增目的基因 PCR 扩增IGF1，在引物中引入NheI+ HindⅢ酶切位点，按以下组分制备PCR 反应体系：5 × Fastpfu buffer 10 μL，dNTP Mix（2.5 mM）4 μL，正向引物（10 μM）2 μL，反向引物（10 μM）2 μL，Fastpfu polymerase 1 μL，模板DNA（100 ng/μL）1 μL，ddH2O 30 μL，Total 50 μL。按以下条件设置反应程序进行PCR 反应：变性95 ℃×3 min 1 个循环，变性95 ℃，退火55 ℃× 30 s 30 个循环，延伸72 ℃× 2 min，延伸72 ℃× 5 min 1 个循环。琼脂糖凝胶回收目的条带进行分析。

1.3.2 载体质粒PDC316-mCMV-ZsGreen 及目的基因NheI+HindⅢ双酶切 酶切反应在37 ℃水浴反应2 h，载体质粒酶切体系如下：质粒PDC316-mCMVZsGreen/IGF1 1 μg，10×Buffer 2 μL，10×BSA 2 μL，NheI 1 μL，HindⅢ1 μL。分别回收质粒PDC316-mCMV-ZsGreen酶切大片段和目的基因酶切产物。

1.3.3 质粒PDC316-mCMV-ZsGreenNheI+ HindⅢ回收大片段与目的基因连接 连接反应在22 ℃反应2 h，连接反应体系如下：目的基因6 μL，PDC316-mCMV-ZsGreen 2 μL，10 × DNA Ligase Buffer 1 μL，T4 DNA Ligase 1 μL。

1.3.4 连接产物转化 取10 μL 上述连接产物和100 μL JM109 感受态细菌混合均匀后冰浴30 min，在42 ℃下热激45 s，立即放置冰上2 min，放入预热至室温的400 μL 的LB 培养基，在37 ℃恒温摇床培养1 h 后，4 000 rpm 离心1 min，弃400 μL 上清夜，用移液器混匀剩余100 μL 后均匀涂布在含100 μg/mL Ampicillin 抗性LB 板上，在37 ℃恒温培养箱中倒置培养过夜。

1.3.5 重组质粒提取、挑选鉴定及病毒包装 选取4 个单菌落接种于含有100 ug/mL Ampicillin 抗性的5 mL LB 培养液中，250 rpm，在37 ℃恒温摇床培养过夜，使用小量质粒抽提试剂盒提取质粒，经质粒NheI+ HindⅡ双酶切鉴定，克隆并切出462 bp 条带。测序验证鉴定正确的重组克隆。测序引物为：

CMV-F（CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG）。PDC316-mCMV-ZsGreen-IGF1 与PDC316-mCMV-ZsGreen 腺病毒病毒包装。用携带有目的基因的重组质粒PDC316-mCMV-ZsGreen、PDC316-mCMV-ZsGreen-IGF1 和骨架质粒共转染HEK293 细胞，获得携有目的基因的腺病毒，然后通过扩增技术获得高滴度的病毒，标记为AD-IGF1，对照病毒为仅携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的AD-GFP。

1.3.6 基因表达重组腺病毒Ad-IGF1 感染效率检测 取对数生长期P3 代MSMSCs，以2.5×105个/瓶接种于到T25 培养瓶中，分为IGF1 感染组（Ad-IGF1）和阴性对照组（Ad-GFP），仅携带GFP 的空载体腺病毒Ad-GFP 作为阴性对照组。在37 ℃，5%CO2α-MEM 基础培养中培养。待细胞贴壁后，将IGF1 基因表达重组腺病毒Ad-IGF1 按感染复数（multiplicity of infection，MOI）为50～200 感 染 细胞，感染细胞后更换α-MEM 成骨诱导培养基培养24 h。每组重复3瓶。24 h后对感染Ad-IGF1和Ad-GFP 的细胞进行显微镜拍照。收集实验组和对照组的细胞，用于qRT-PCR 检测。

1.4 Noggin 或 者SB203580 处 理 感 染Ad-IGF1 的细胞

取感染Ad-IGF1 的P3 代MSMSCs 以1 × 105个/孔接种于6 孔板中，分为Noggin 处理组（Ad-IGF1+Noggin），单纯Ad-IGF1 感染的对照组（Ad-IGF1）以及Ad-IGF1 感染合并α-MEM 培养基培养的空白对照组（Ad-IGF1+ medium）。采用BMP-Smad 依赖特异性抑制剂Noggin，进行功能实验探索IGF1 在MSMSCs 成骨中作用机制。具体细胞处理步骤如下：感染Ad-IGF1 的P3 代MSMSCs 以1 × 105个/孔接种于6 孔板中，37 ℃，5%CO2α-MEM 基础培养基中培养。待细胞贴壁后100 g/mL BMP-Smads 信号通路抑制剂Noggin 或者等体积的α-MEM 培养基预处理细胞1 h，之后更换α-MEM 成骨诱导培养基培养3 d，单纯感染Ad-IGF1 细胞在α-MEM 成骨诱导培养基中培养3 d，并作为对照组，每组重复3 孔。

同上，p38MAPK 特异性抑制剂SB203580 处理及分组和Noggin 处理一致，其预处理浓度为20 uM，分组为单纯Ad-IGF1 感染的对照组（Ad-IGF1）以及SB203580 处理组（Ad-IGF1+SB203580）。

1.5 茜素红染色

为了明确不同实验组（Ad-IGF1、Ad-IGF1+Noggin、Ad-IGF1+ medium）的MSMSCs 钙盐沉积情况，使用茜素红染色进行分析。具体步骤如下：4%的多聚甲醛固定30 min，PBS 漂洗3 次，每次5 min，0.1%的茜素红（pH 7.2）染色10 min，PBS 漂洗后拍照。

1.6 免疫组化染色

细胞爬片收集后，经过固定，透膜和抗原修复后，加入1∶400 的p-Smad1/5 抗体，4 ℃下孵育过夜，1∶500 羊抗兔IgG-HRP 耦联一抗，DAB 显色，苏木素复染，拍照并分析。

1.7 qRT-PCR

Trizol 收集各个时间点各组细胞的RNA，经过萃取，酒精清洗后得到干净的RNA，Nanodrop 测定浓度后，逆转录1 000 ng/样本为cDNA，按照表1 设计引物，其中GAPDH 为内参，定量检测IGF1，Runx2、ALP 和OPN mRNA 表达量。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 Nucleotide sequences of the qRT-PCR primers

1.8 Western blot 检测

RIPA 收集细胞蛋白，BCA 法测量浓度后，取20 μg 蛋白进行定量，电泳分离不同大小蛋白，使用PVDF 膜进行蛋白转膜，裁剪不同分子量大小的膜，经过封闭，清洗后，孵育一抗（BMP2、Smad1/5、p-Smad1/5、RUNX2、OPN、p-p38）过夜；次日进行清洗，HRP 显影，定量分析。

1.9 统计学方法

实验数据用均数±标准差表示，采用SPSS19.0统计学软件分析，采用独立样本t检验来比较两组差异，采用单因素方差分析比较三组及以上差异。P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 IGF1 基因表达重组腺病毒构建及感染效率

在AD-IGF1 和AD-GFP 包装第1 天，通过荧光显微镜观察HEK293 细胞内可见绿色荧光，呈满天星状分布，包装第9 天，呈彗星状分布，说明IGF1和GFP 基因表达腺病毒包装过程顺利（图2a）。同时经凝胶电泳检测示质粒酶切后的两个产物均为阳性克隆，产物大小为462 bp 的IGF1 目的基因条带（图2b）。MSMSCs 感染携带有绿色荧光蛋白的AD-IGF1 和AD-GFP 后，免疫荧光检测细胞形态没有明显改变，仍然呈多角形或长梭形，细胞质中可见绿色荧光信号（图2c、2d）。MSMSCs 细胞感染Ad-IGF1 培养24 h 后IGF1 mRNA 表达量明显升高，较感染AD-GFP 组升高了5 倍，两组间表达量差异有统计学意义（图2e）。

2.2 MSMSCs 的IGF1 上调促进磷 酸 化Smad1/5 核转位，并呈时间和剂量依赖性正向调控BMP2 及磷酸化Smad1/5 的表达

通过免疫组化结果显示，感染Ad-IGF1 的MSMSCs 高表达磷酸化Smad1/5，表达部位主要位于胞核，部分胞浆亦可见表达；感染Ad-GFP 细胞的胞核和胞浆不表达或低表达磷酸化Smad1/5，空白对照不表达（图3a～3c）。进一步通过使用不同浓度的Ad-IGF1（MOI 50-100、150-200、250-300）作用于MSMSCs。细胞成骨诱导3 d 后，基于免疫印迹实验发现，与Ad-GFP 阴性对照组相比，BMP2 蛋白表达逐渐增强，且随着Ad-IGF1 滴度增加呈梯度上升，各实验组与对照组相比，差异均有统计学意义（图3d）。Smad1/5 总蛋白量无变化，而Smad1/5磷酸化（p-Smad1/5）水平增高，且随着Ad-IGF1 滴度增加呈梯度上升，各实验组与对照组相比，差异均有统计学意义（图3e）。同时观察了不同时间点（3 h、6 h、12 h、24 h、48 h）的BMP2 和p-Smad1/5 的动态变化。与0 h 组相比，BMP2 蛋白水平呈时间依赖性增强趋势，在24 h 时达到高峰，48 h 后表达开始轻微减弱，但48 h 组仍高于0 h 组（图3f）。Smad1/5 总蛋白量无变化，Smadl/5 的磷酸化水平在12 h 时达到高峰，24 h 后表达轻微减弱，但24 h 和48 h 组仍高于0 h 组（图3g）。

2.3 IGF1 依赖BMP-Smad 信号通路而非p38MAPK信号通路调控MSMSCs 的成骨分化

为了进一步探索IGF1 介导MSMSCs 的成骨分化的内在核心机制，首先使用BMP-Smads 信号通路抑制剂Noggin 处理Ad-IGF1 感染的MSMSCs，成骨诱导培养3 d，发现磷酸化Smad1/5 水平降低明显，与单纯感染Ad-IGF1 的对照组相比，两组间表达量差异有统计学意义（图4a）。并且成骨相关的标志物Runx2、OPN 和ALP mRNA 表达量降低明显，与对照组相比，各组间mRNA 表达量差异有统计学意义（图4b）。更重要的是，茜素红染色结果表明单纯感染Ad-IGF1 的细胞α-MEM 成骨诱导培养基中培养28 d 后，有大量染为红色的矿化结节形成；Noggin 处理Ad-IGF1 感染的MSMSCs 后，成骨诱导培养28 d 也有矿化结节形成，但矿化结节明显 减少；Medium 处 理Ad-IGF1 感 染的MSMSCs 后（空白对照），其矿化结节量和单纯感染Ad-IGF1 类似（图4c～4e）。然后验证BMP-非Smads 信号通路在IGF1 调控MSMSCs 成骨的作用。采用p38MAPK信号通路抑制剂SB203580 处理Ad-IGF1 感染的MSMSCs 成骨诱导培养3 d 后，p38 磷酸化水平与单纯感染Ad-IGF1 的对照组相比，两组间表达量差异无统计学意义（图4f）。并且成骨相关的标志物Runx2、OPN 和ALP mRNA 表达量与单纯感染Ad-IGF1 的对照组相比变化不明显（图4g）。这结果提示IGF1 主要通过BMP-Smads 信号通路调控MSMSCs成骨分化效应。

Figure 2 Restriction of the AD-IGF1 gene and its infection efficiency图2 IGF1 基因表达重组腺病毒构建及感染效率

Figure 3 Upregulation of IGF1 promotes p-Smad1/5 protein nuclear translocation and positively regulates BMP2 and p-Smad1/5 protein expression in MSMSCs in a time-and dose-dependent manner图3 MSMSCs 中IGF1 上调促进p-Smad1/5 核转位，并呈时间和剂量依赖性正向调控BMP2 及p-Smad1/5 的表达

Figure 4 IGF1 depends on the BMP-Smad but not the p38MAPK signaling pathway to regulate MSMSCs osteogenic differentiation图4 IGF1 依赖BMP-Smad 信号通路而非p38MAPK 信号通路调控MSMSCs 的成骨分化

3 讨 论

上颌窦黏膜干细胞是一类具有成骨潜能的上颌窦黏膜来源的细胞，在上颌窦底提升术后空间成骨及维持黏膜内稳态中扮演重要作用［4］。IGF1是一种具有内分泌和旁分泌特性的多功能肽，通过与细胞表面的IGF1 受体结合来激活受体的酪氨酸激酶活性，然后使受体-配体复合物发生内化并激活信号反应来调节细胞生长、分化和细胞外基质中多种因子的表达［5-6］。课题组在前期研究工作中发现IGF1 上调可以促进上颌窦黏膜干细胞的碱性磷酸酶、RUNX2 和OPN 的表达，正向参与上颌窦黏膜干细胞的成骨分化效应，然而IGF1 内在的成骨调控通路未进行深入探讨［7］。在骨髓间充质干细胞成骨向分化过程中，有研究表明BMP2 刺激细胞成骨分化的功能需依赖于IGF1 激活相关信号通路如PI3K/AKT 或MAPK 信号通路［8］。而BMP2 为骨基质中存在的重要骨生长因子，可通过与细胞膜上I 型和Ⅱ型受体结合，激活下游信号蛋白Smad1 或Smad5 蛋白质羧基末端，从而磷酸化Smad1/5，磷酸化的Smad1/5 与Smad4 结合，形成复合物后由胞浆进行核转位，在核内蓄积后直接作用于下游的靶基因，或与其它转录调节因子一起调控下游靶基因［9-10］。因此课题组推测IGF1 是否可以在细胞成骨分化过程中激活BMP-Smads 信号转导通路调控上颌窦黏膜干细胞的成骨效应。

为了揭示IGF1 和BMP2-Smads 的关系，本研究采用PDC316-mCMV-ZsGreen-IGF1 载体构建重组腺病毒Ad-IGF1，经测序证明载体所连序列正确。然后以不同滴度的Ad-IGF1（50-100、150-200、250-300）作用于上颌窦黏膜干细胞成骨诱导培养24 h后，通过Western blot 检测发现，BMP2 蛋白表达逐渐增强，且随着Ad-IGF1 滴度增加呈梯度上升，Smad1/5 蛋白被激活，磷酸化水平逐渐升高。并且在不同时间点检测BMP2 蛋白水平和磷酸化Smad1/5 水平变化，有趣的是，IGF1 可呈浓度和时间依赖性上调BMP2 表达和Smad1/5 活性。免疫组化结果也证实IGF1 可以促使磷酸化Smad1/5 从上颌窦黏膜干细胞的胞浆转移到核内。随后，为进一步探讨BMP-Smads 信号在IGF1 介导的促上颌窦黏膜干细胞成骨分化中的作用，采用Noggin 进行BMP-Smads 信号抑制。Noggin 是BMP-Smads 信号通路的直接抑制剂，其结构上存在典型的“胱氨酸结”结构域，线性排列的Noggin 二聚体同呈蝴蝶形的BMP 二聚体结合，形成一个较大的戒指样结构，能够有效地屏蔽BMP 上的受体结合位点，抑制BMP 受体的激活和下游靶蛋白的磷酸化［11-13］。使用Noggin 处理Ad-IGF1 感染的细胞后，再对细胞进行成骨诱导分化，发现与单纯感染Ad-IGF1 组相比，磷酸化Smad1/5 蛋白表达量明显降低，成骨相关标志物Runx2、OPN 和ALP mRNA 表达量降低明显，矿化结节明显减少。说明BMP-Smads 信号通路是IGF1 活化成骨效应不可或缺的。据此，本实验研究结果表明IGF1 可通过BMP2-Smad1/5 信号通路，促进BMP2 的表达并诱导细胞内Smad1/5 磷酸化和核转位机制，调控上颌窦黏膜干细胞成骨分化效应。

随着对BMPs 信号通路研究增加，逐渐明确BMPs 通路可分为2 种：一种是Smads 蛋白依赖性信号转导通路，这种信号传导通路需通过经典的Smads 信号分子传递信号；另外一种是Smads 蛋白非依赖性信号转导通路，这种信号传导通路不直接依赖转录因子Smads 的激活［14-16］。更重要的是，在成骨机制研究中证实细胞成骨分化除了依赖经典的BMP-Smads 信号转导通路外，也可通过Smads蛋白非依赖性信号通路（如MAPK、PI3K 等）进行信号传导［17-18］。其中p38MAPK 是其中一条重要的通路，可以通过胞外信号激活MAPK，继而激活MKK3/MKK6，再激活p-p38 来调控信号转导过程［19］。现有的研究发现p38MAPK 信号转导可激活相关的转录因子，引起细胞增殖、分化，参与细胞的应激反应和介导细胞的骨架重构等一系列生物学效应，在成骨细胞分化中具有重要的调控作用［20-21］。然而p38MAPK 信号通路是否能在IGF1 介导下调控上颌窦黏膜干细胞的成骨效应尚不明确。

基于此，本研究进一步探讨p38MAPK 信号通路是否参与IGF1 介导的上颌窦黏膜干细胞成骨分化进程。 使用p38MAPK 信号通路抑制剂SB203580进行功能实验。SB203580，4-（4 氟苯基）-2-（4-甲基亚磺酰苯基）-5-（4-吡啶基）-咪唑，一种药理的化学合成物，可以抑制p38MAPK 对MAPK/APK-2 的激活以及后续磷酸化的级联反应，是p38MAPK 的选择性抑制剂［22］。SB203580 处理Ad-IGF1 感染的细胞后成骨诱导培养3 d，与单纯感染Ad-IGF1 的对照组相比，磷酸化p38 水平无明显变化，成骨标志物Runx2、OPN 和ALP mRNA 表达水平亦无明显变化，实验结果提示p38MAPK 信号通路可能在IGF1 介导的促上颌窦黏膜干细胞成骨分化过程中并不发挥作用。SB203580 抑制效果在上颌窦黏膜干细胞中p-p38 及成骨基因变化不明显的原因可能是因为：①SB203580 通过与ATP 结合区连接来抑制p38MAPK 的催化活性，但是不能抑制上游激酶对p38MAPK 的磷酸化［23］，因此p-p38 的表达变化不明显；②p38MAPK 信号通路在炎症调节及发生发展中具有重要意义，其可能在上颌窦黏膜干细胞成骨分化中，其成骨效应作用甚微，从而成骨基因变化不明显；③不排除在上颌窦黏膜干细胞成骨分化进程中存在p38 竞争性结合因子，从而影响了抑制剂本身的药物机理。实验结果较倾向于p38MAPK 可能在IGF1 介导的上颌窦黏膜干细胞成骨过程中并不是主导的信号调节通路。

总之，上颌窦黏膜干细胞成骨分化过程中，IGF1 通过经典的Smads 蛋白依赖性信号转导通路BMP2-Smad1/5 促进成骨，而Smads 蛋白非依赖性信号转导通路p38MAPK 在IGF1 介导的上颌窦黏膜干细胞成骨过程中可能并不发挥作用。