miRNA-10b与乳腺癌相关肿瘤标志物在早期乳腺癌中诊断效能比较*

姚 颖，陆奎英，张 敏，丁昌平

(扬州大学附属医院检验科，江苏扬州 225002)

乳腺癌多发生于乳腺导管上皮中，在女性恶性肿瘤中，发病率较高。目前乳腺癌诊断的金标准为组织病理学染色，辅助诊断检查包括有影像学检查乳腺X钼靶照相及血清学检查乳腺相关肿瘤标志物[1-2]。病理活检及影像学检查在区分正常乳腺组织及乳腺恶性肿瘤中均有较高的准确率及特异性，但在方法学上存在限制性，包括病理标本取材创伤、放射性污染及高昂的检测费用等。因此寻找特异性血清学乳腺癌标志物辅助诊断，对准确筛查出早期乳腺癌有积极的临床意义。传统乳腺癌血清诊断指标包括：癌胚抗原(CEA)、糖类抗原153(CA153)、糖类抗原199(CA199)和糖类抗原125(CA125)等，其余标志物在乳腺癌患者中水平也有变化，但特异性不佳。研究表明，在Ⅰ/Ⅱ期乳腺癌患者中，CA153水平升高不明显对早期乳腺癌的诊断效能灵敏度不理想[3]。近年来发现微小核糖核酸(miRNA)在肿瘤的发生、发展及转移中起重要作用，其中微小核糖核酸-10b(miRNA-10b)与乳腺癌的恶性程度紧密相关，miRNA-10b可作为早期乳腺癌筛查的理想血清学指标[4]。本项研究评估了miRNA-10b及几项传统血清肿瘤标志物在健康人群、乳腺良性疾病、乳腺恶性肿瘤早期及晚期患者组织中的表达，并探讨上述指标在早期乳腺癌中的诊断效能，报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015 年7 月至2017 年12月本院门诊及住院的乳腺疾病女性患者92例。其中乳腺癌患者50例，年龄39～68岁，平均(42.64±13.47)岁，早期乳腺癌患者30例、晚期乳腺癌患者20例。乳腺良性疾病患者42例(乳腺增生15例、乳腺纤维瘤8例、乳腺炎19例)，年龄21～59岁，平均(38.64±12.12)岁。另选健康对照者50例，均为体检合格女性，年龄22～65岁，平均(39.64±10.23)岁。四组受试者的年龄、体质量指数、吸烟、喝酒等一般资料差异无统计学意义，具有可比性(P>0.05)。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1诊断标准 乳腺良性疾病：经病理学鉴定排除乳腺癌恶性肿瘤可能。乳腺增生：伴有一侧或两侧出现单个或多个肿块，患有周期性乳房胀痛，月经后肿块及疼痛缓解[3,5]。乳腺炎：伴有乳房胀痛肿块，皮肤微红，体温可能升高，中性粒细胞可能升高[6]。乳腺纤维瘤：乳房肿块无痛性，多为圆形，超声提示境界清楚，边缘整齐，活动度较大[7]。乳腺癌：病理检查确诊乳腺浸润性导管癌，入组患者为新发乳腺癌未经手术及放疗、化疗药物治疗。50例乳腺癌患者按TNM分期为Ⅰ、Ⅱ期的患者30例，Ⅲ、Ⅳ期患者20例[8]。

1.2.2miRNA检测 所有受试者空腹采集静脉血2 mL于乙二胺四乙酸抗凝管中，取抗凝全血300 μL，加入miRNA提取液，参照说明书步骤，提取总RNA。将提取到的RNA进行逆转录，反应体系如下：模板RNA 6 μL；100 mM dNTPs 0.3 μL；10×RT Buffer 1.5 μL；RNase Inhibitor(20 U/μL)0.19 μL；ddH2O 1.01 μL。反应条件：16 ℃ 30 min；42 ℃ 30 min；85 ℃ 5 min；4 ℃结束。以U6做实验内参，行荧光定量PCR法扩增实验，反应体系为：TaqMan Master Mix 2×12.5 μL； Primer 3.75 μL；ddH2O 6.25 μL。反应条件：95 ℃ 10 min；55 ℃ 2 min；72 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 4 min；循环12次，99.9 ℃ 10 min；4 ℃结束。实验重复3次，反应体系中荧光信号达到所设定阈值所经历的循环数即为循环阈值(Ct)，以U6为内参，采用2-△△Ct计算miRNA-10b的相对表达水平，即△Ct=Ct目的基因-CtU6。

1.2.3血清CEA、CA153、CA199和CA125检测 患者空腹采集静脉血5 mL，3 000 r/min，离心5 min，沉淀后分离血清，等待检测。采用电化学发光法进行检测，使用罗氏全自动电化学发光仪及其配套试剂盒，严格执行各项质控标准。各项指标参考范围如下：CA153<25 U/mL，CA199<34 U/mL，CA125<35 U/mL。

2 结 果

2.1各组血清CEA、CA153、CA199、CA125、miRNA-10b表达水平比较 健康对照组及乳腺良性疾病组患者血清中CEA、miRNA-10b及3组乳腺癌相关肿瘤标志物表达水平显著低于乳腺恶性肿瘤组，差异有统计学意义(P<0.05)。在早期乳腺癌组患者血清中，CA153及miRNA-10b的表达水平均有明显升高，水平与晚期乳腺癌患者组相当，差异无统计学意义(P>0.05)。其余血清肿瘤标志物表达略有升高，高于健康对照组及乳腺良性疾病组，低于晚期乳腺癌组，且差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2各指标在两两鉴别健康对照组、早期乳腺癌组及晚期乳腺癌组中的诊断效能评价 血清CEA、CA153、CA199、CA125、miRNA-10b在鉴别诊断健康对照组与晚期乳腺癌组的AUC均高于0.80，且差异有统计学意义(P<0.05)，能较好鉴定出乳腺癌，特异度高，灵敏度稍低。其中CA153及miRNA-10b的诊断效能最佳，临界诊断值分别为1.8 ng/mL及4.52 U/mL。上述血清指标对健康对照组及早期乳腺癌诊断效能的分析结果显示，除miRNA-10b及CA153外，其余几项血清肿瘤相关指标均无法鉴别早期乳腺癌。miRNA-10b在早期乳腺癌的鉴别诊断表现优于乳腺癌特异性肿瘤相关抗原CA153，其诊断AUC为0.97，特异度达到100%，见表2、3及图1、2。

表1 不同指标在各组中表达水平比较

注：与健康对照组比，*P<0.05；与乳腺良性疾病组比，△P<0.05；与早期乳腺癌组比，#P<0.05。

表2 各指标对健康对照及晚期乳腺癌组鉴别诊断效应评价

表3 各指标对健康对照及早期乳腺癌组鉴别诊断效应评价

图1 血清CEA、CA153、CA199、CA125和miRNA-10b在健康对照组与晚期乳腺癌组的诊断ROC

图2 血清CEA、CA153、CA199、CA125和miRNA-10b在健康对照组与早期乳腺癌组的诊断ROC

2.3多元Logistic回归分析各指标与乳腺癌的关系 以健康对照组及乳腺癌组做二分类变量，运用多元Logistic回归模型对上述指标进行分析。结果显示CA153及miRNA-10b水平升高是乳腺癌发生的独立危险因素OR=1.09、12.47；95%CI为1.05～1.13、2.62～59.34，见表4。

表4 多元Logistic回归分析各指标与乳腺癌恶性的关系

3 讨 论

目前已经发现多种与乳腺癌相关的血清标志物，如CEA、CA153、CA199和CA125[9]，但同时分析四项血清标志物用于鉴别诊断乳腺良性疾病、乳腺癌及乳腺癌的早晚期报道较少。CA153是从转移性乳腺癌中分离出的一种肿瘤相关抗原，在健康对照组中表达低，乳腺癌组中表达增高，CA153的表达与治疗效果、临床分期、肿瘤大小及腋窝淋巴结状况密切相关，对健康人群与早晚期乳腺癌患者的鉴别诊断效能高于其余肿瘤指标且特异性高[10]，TANG等[11]、LI等[12]通过Meta分析表明CA153可用于鉴别乳腺癌和健康人群。CEA是一种胚胎性抗原，同时存在于消化道肿瘤、肺癌等多种恶性肿瘤中，在乳腺癌患者血清中也可检测到CEA过量表达。CEA作为广谱肿瘤标志物，表达受全身多组织微环境影响，因此，对乳腺癌诊断的特异度及灵敏度均低于CA153[13]，如WANG等[9]研究显示乳腺癌外周血的CEA阳性比例低于CA153。抗原存在于上皮性卵巢癌细胞中，是一类可与OC125结合的糖类抗原，常被视作卵巢上皮癌的肿瘤标志物应用于临床，在恶性乳腺肿瘤患者中也有表达，阳性率稍低与卵巢癌。CA125 AUC小于CA153，特异较差[14]。CA199常作为胰腺癌、胆囊癌等恶性肿瘤的辅助诊断指标，同时在乳腺癌患者中也可高表达，与CA125类似，CA199单独用作乳腺癌的诊断特异性较差[15]。CEA、CA199及CA125均非乳腺癌特异性的肿瘤标志物，尽管在晚期乳腺癌患者表达升高，阳性率并不理想。早期乳腺癌患者中，除CA153，其余肿瘤标志物水平仅有轻微升高，无法作为早期乳腺癌的筛查指标,WANG等[16]研究也表明CA125和CA199不可用于诊断恶性胸腔积液。

作为miRNA家族成员之一，miRNA-10b是非编码单链小RNA分子，定位于2号染色体3区1带，与乳腺癌恶性程度高度相关，是首先被鉴定出的在转移性乳腺癌细胞系中高度特异性表达的miRNA之一[17]。本研究发现，与健康对照组比较，miRNA-10b在乳腺良性疾病组中表达略有升高，但差异无统计学意义。而在早期及晚期乳腺癌组中，miRNA-10b表达均显著升高，成为筛选早期乳腺癌的理想指标(AUC=0.97)，优于乳腺癌特异性肿瘤指标CA153，为其余血清肿瘤相关指标所不能及。本研究中所报道的miRNA-10b在筛查早期乳腺癌患者中具有较高的准确率，是体检中筛查早期乳腺癌的理想血清学指标[14]。miRNA-10b的表达变化与乳腺癌细胞的侵袭及转移也密切相关。基础实验结果表明，将乳腺癌细胞移植至小鼠的乳腺脂肪垫中，可在肺部、食道、胰腺等组织中检测到癌细胞转移，可能的机制在于miRNA-10b介导了Twist诱导的上皮间质转化、抑制抑癌基因的翻译和激活细胞迁徙及细胞外基质的重塑基因，进一步证实miRNA-10b可作为抗乳腺癌转移的一个潜在靶点及预后标志物[4]。

4 结 论

miRNA-10b在乳腺癌患者中特异性表达，在临床上可作为筛查早期乳腺癌的理想血清学指标，其诊断效能优于传统的乳腺癌相关肿瘤标志物。然而对乳腺癌的诊断，也不应忽视基本临床触诊与影像学检查的结合及病理染色的确认，最大程度减少临床误诊、漏诊。