超声引导下细针穿刺洗脱液甲状腺球蛋白检测在分化型甲状腺癌淋巴结转移诊断中的应用进展

李俊康，王知力

1解放军63820部队医院 超声科，四川绵阳 621000；2解放军总医院第一医学中心 超声诊断科，北京100853

分化型甲状腺癌起源于甲状腺滤泡上皮细胞，包括甲状腺乳头状癌和滤泡性甲状腺癌，是甲状腺恶性疾病中最常见的组织学类型，大多数患者预后较好[1]。20% ～ 65%的分化型甲状腺癌患者发生淋巴结转移，4% ～ 20%的患者在初次手术后出现转移或局部复发，淋巴结转移会降低分化型甲状腺癌患者的生存率[2-6]。所以早期准确判断淋巴结是否发生转移，对肿瘤的分期和治疗至关重要。目前转移性淋巴结的评估主要依赖于颈部超声、超声引导下细针穿刺抽吸细胞学检查(fine needle aspiration biopsy，FNAB)及细针穿刺洗脱液甲状腺球蛋白检测(thyroglobulin measurement in the needle washout after fine-needle aspiration，FNA-Tg)、 全 身放射性碘扫描等。超声一直以来都是颈部淋巴结评估最常用的检查方法，具有很高的特异性(80% ～90%)，但是敏感度较低，尤其是对较小淋巴结的评估更为困难[7]。FNAB敏感度和特异性均较高，但是取材受操作者的经验、淋巴结的大小或囊性变等因素干扰，假阴性50%以上由样本不合格所引起[8-9]。此外，粒细胞、淋巴细胞、多核巨细胞和少量上皮细胞等复杂细胞学特征也会影响FNAB的诊断准确性[10]。FNA-Tg对FNAB进行了极大的补充，二者结合可以显著提高转移性淋巴结诊断的准确性[11]。本文就FNA-Tg在分化型甲状腺癌淋巴结转移诊断中的应用进展进行综述，为进一步临床研究提供参考。

1 甲状腺球蛋白的生物学特性

甲状腺球蛋白(thyroglobulin，Tg)是一种仅由甲状腺滤泡上皮细胞分泌的大分子糖蛋白，分子量660 kU，沉降系数19 S[12]。Tg由两条相同的单体肽链组成二聚体，每个单体都有约60个二硫键和17个糖基化位点，使蛋白质具有显著的稳定性和溶解性[13]。Tg单体肽链的66个酪氨酸中大约有30个是碘化的，其中只有少数作为甲状腺激素形成的底物。碘化作用后，供体二碘或单碘酪氨酸的芳香环被转移到近端受体二碘酪氨酸，形成连接在多肽主链上的甲状腺素或三碘甲状腺原氨酸，并在供体位置留下一个脱氢丙氨酸。正常情况下，每个Tg结合2.5个甲状腺素和0.7个三碘甲状腺原氨酸分子，储存于甲状腺滤泡腔内[14]。Tg经胞质溶酶体内吞水解，甲状腺素和三碘甲状腺原氨酸释放入血，同时少量的Tg也释放入血[15]。体循环中的Tg通过肝代谢后从机体清除，甲状腺切除术后Tg的半衰期约65.2 h，术后约25 d左右Tg降至5 ～ 10 ng/ml以下[16]。当分化型甲状腺癌淋巴结转移时，转移淋巴结内的甲状腺滤泡上皮细胞也能分泌Tg。在进行颈部淋巴结的FNAB时，针尖可携带少量Tg，通过化学免疫荧光法等检测方法，能敏感地检测到这些少量的Tg。Tg来源的单一性、结构的稳定性和可检测性，使其成为甲状腺特异性的肿瘤标志物。

2 可疑恶性淋巴结的选择

FNAB及FNA-Tg诊断的准确性很大程度依赖于可疑恶性淋巴结的选择。在进行FNAB前，可疑恶性淋巴结选择不当可造成分化型甲状腺癌淋巴结转移的漏诊。术前可疑恶性淋巴结的选择主要依靠颈部超声检查，熟悉分化型甲状腺癌淋巴结转移的超声图像特征在很大程度上可以避免因可疑恶性淋巴结选择不当而造成的取样误差。分化型甲状腺癌颈部淋巴结转移的可疑恶性超声特征包括淋巴门结构缺失、囊性变、钙化、高回声实性成分、异常血流、长径/短径＜2等[17-19]。良性淋巴结在超声上通常表现为梭形或卵圆形，可见规则的淋巴门结构[18]。淋巴门结构由动脉、静脉、输出淋巴管、脂肪组织等构成，肿瘤细胞侵犯淋巴门结构，引起淋巴门结构的偏移或缺失。淋巴门结构缺失对可疑淋巴结评估的敏感度较高(84% ～96%)，但是特异性相对较低(49% ～ 84%)，准确率74% ～ 87%。淋巴结内高回声实性成分由胶质沉积或肿瘤浸润引起，其评估可疑淋巴结的敏感度为38% ～ 71%，特异性为81% ～ 100%，准确率为67% ～ 76%。淋巴结的囊性变由肿瘤液化、坏死或胶质沉积引起，其评估可疑淋巴结的敏感度较低(13% ～ 26%)，但特异性较高 (98% ～ 100%)，准确率为56% ～ 65%。恶性淋巴结的钙化通常由砂粒体、梗死或肿瘤血栓等成分形成，因其体积较小，在超声检查中往往不容易被识别。钙化评估可疑淋巴结的敏感度为14% ～ 55%，特异性为97% ～100%，准确率为59% ～ 76%。异常淋巴结的血流多以周围型为主，其敏感度仅32% ～ 52%，特异性92% ～ 96%，准确率62% ～ 71%。当肿瘤细胞在淋巴结内从外周向中央逐步浸润时，淋巴结变形，趋向于圆形，长径/短径＜2，其敏感度35% ～65%，特异性 61% ～ 91%，准确率 62% ～ 72%[17-19]。除了上述几种征象外，淋巴结的短径＞5 ～ 8 mm对可疑恶性淋巴结的评估亦有较高的参考价值。

3 样本留取方法

FNA需在超声引导下进行，针尖需实时可见，这样既能确保安全又能提高取样的准确性。在进行FNA时，穿刺不够精准、穿刺针经过正常的甲状腺组织、同一点位穿刺次数过多等均可造成样本污染。一项研究报道显示，理论上血液对针尖洗脱液的污染率为5% ～ 20%[20]。取样可用24 ～ 27 G穿刺针或5 ml注射器针头，超声引导下精确穿刺进入靶区域，负压下来回抽插3 ～ 5次，无负压状态下取出穿刺针，把较多的组织细胞学送检后，针尖在缓冲液内冲洗。缓冲液主要包括三种：0.9%氯化钠注射液、无甲状腺球蛋白的血清和水。0.9%氯化钠注射液因为使用方便和成本低廉而被广泛应用，但是因为“基质效应”的影响，测量结果可能会偏高。无甲状腺球蛋白的血清可以避免“基质效应”的影响，但是成本高昂、制备困难[11]。此外，洗脱液的用量和收集管的类型也会对检查结果造成影响。Zhang等[21]认为，Tg检测的准确性取决于取样的准确性和洗脱液总量不超过1.5 ml。Borel等[20]通过实验发现，针尖在1.0 ml洗脱液中来回冲洗3次可以将97%以上的Tg从针尖上洗出。既往研究通过对比不同收集管中FNA-Tg的浓度后发现，血清分离管和肝素锂管可降低甲状腺球蛋白浓度，因此建议在普通血清管中收集洗脱液，并且使用1.0 ml 0.9%氯化钠注射液作为洗脱液最为理想[22]。

4 Tg的检测

甲状腺球蛋白的检测方法主要包括免疫测定法、放射免疫测定法、酶联免疫吸附测定法、免疫放射测定法和免疫化学发光法等。各个检测方法之间的功能敏感度和干扰因素不尽相同，而且分析方法之间存在明显差异性。早期研究显示，Tg的浓度在不同检测方法中差异可达40% ～ 60%[23]。尽管现在“有证标准物质”(BCR457，欧盟委员会，标准物质和方法研究所)的引入和使用大大降低了方法间的可变性，但并不能完全消除方法间的差异[24-25]。因此，推荐使用经过认证的免疫测定法进行Tg检测，实验室必须经过国家或国际质量认证，并对照“有证标准物质”进行校准。为确保临床随访的纵向一致性，应在同一实验室连续检测Tg，每次使用相同的检测方法[26]。目前，没有指南和文献推荐使用何种特定的方法进行Tg检测，只要满足分析灵敏度的要求即可。

5 FNA-Tg对术前和术后异常淋巴结的诊断

5.1 术前异常淋巴结的FNA-Tg诊断标准 既往文献报道，FNA-Tg在术前和术后淋巴结的评估中都具有有效性，但是诊断性能在术前和术后存在差异[27-30]。Pak等[27]进行了一项Meta分析，筛选出以1.0 ml 0.9%氯化钠注射液作为洗脱液的843个淋巴结FNA-Tg的研究数据。FNA-Tg术前检测的合并敏感度和特异性分别为0.89(95% CI：0.82 ～0.95)、0.60(0.49 ～ 0.70)；术后检测的合并敏感度和特异性分别为 1.0(0.83 ～ 1.0)、1.0(0.92 ～ 1.0)；建议术前和术后分别选择FNA-Tg浓度为32.04 ng/ml和0.9 ng/ml作为评估颈部淋巴结转移的标准。Jeon等[31]认为应根据血清Tg浓度选用两种不同的FNA-Tg诊断阈值，当术前使用1.0 ng/ml的FNATg诊断阈值时，其特异性较低，临床应用受到限制，因为良性淋巴结的FNA-Tg浓度随着血清Tg浓度的升高而升高。血清Tg较低的患者(＜1.0 ng/ml)，FNA-Tg诊断阈值为1.0 ng/ml具有良好的诊断效能，此时与术后患者的情况一样，不用考虑甲状腺球蛋白抗体状态。在高血清Tg(＞1.0 ng/ml)患者中，FNA-Tg 19.0 ng/ml为最佳诊断阈值(敏感度93%，特异性100%)。此外，在血清Tg较高的患者中，与固定的FNA-Tg值作为诊断阈值相比，Tg比值(FNA-Tg/sTg)为0.5具有更高的诊断效能(敏感度98%，特异性100%)[31]。在大多数情况下，术前未常规进行Tg检测，因此术前FNA-Tg的文献报道较少，FNA-Tg在术前诊断中的效能在未来需要更多的研究来证实。

5.2 术后异常淋巴结的FNA-Tg诊断标准 美国甲状腺学会(American Thyroid Association，ATA)指南、美国临床生化科学院(National Academy of Clinical Biochemistry，NACB)指南和2006欧洲共识一致推荐在甲状腺癌术后常规随访中进行Tg检测[32-34]。然而，术后多久进行Tg检测、每次检测间隔多长时间尚无统一结论。美国NACB指南和2006欧洲共识建议在手术后6 ～ 8周和放射性碘治疗后3个月才能开始进行Tg检测，具体开始时间应由主治医师根据患者的高危因素决定。Tg结构相对稳定，半衰期65.2 h，在手术后立即或放射性碘治疗后3个月内进行Tg检测得到的结论不能可靠地反映患者的病情[35]。美国ATA指南推荐每间隔6 ～ 12个月进行一次Tg检测，而2006欧洲共识未建议具体的间隔时间。

既往研究已证实FNA-Tg在分化型甲状腺癌患者颈部淋巴结转移诊断中的有效性，FNAB和FNATg相结合可以显著提高分化型甲状腺癌淋巴结转移诊断的准确性[36]。但是FNA-Tg的诊断阈值尚未达成共识，目前诊断阈值较多应用1.0 ng/ml[17,21,37-38]。在Zhang等[21]的研究中，以1.0 ng/ml作为诊断阈值，FNA-Tg的敏感度为100%，特异性为96.9%，阳性预测值为80%，阴性预测值为100%。Zhu等[39]对2 670个异常淋巴结进行Meta分析后发现，诊断阈值为1.0 ng/ml时敏感度最高(0.94)，诊断阈值为40.0 ng/ml时特异性最高(0.97)。FNA-Tg的总体合并敏感度为 0.91(95% CI：0.87 ～ 0.93)，特异性为 0.94(95% CI：0.91 ～ 0.96)，回归分析发现FNA-Tg的敏感度主要与诊断阈值的选取和血清Tg状态有关。也有其他研究提出不同的观点。有研究发现FNA-Tg的最佳诊断阈值为28.5 ng/ml，其诊断敏感度、特异性和准确性均显著高于FNAB。此时FNA-Tg的诊断准确率为99%，而FNAB的诊断准确率仅为83%。当诊断阈值设置为1.0 ng/ml时，FNA-Tg的诊断敏感度、特异性和准确率均低于FNAB[40]。Lee等[41]认为，FNA-Tg评估淋巴结时，不应单独应用单一诊断阈值进行判断，应根据患者甲状腺组织残留情况、血清Tg状态等进行诊断阈值的合理选择。在他们的研究中，总体最佳诊断阈值为2.2 ng/ml。在FNAB阴性的病例中，如果没有甲状腺组织残留，FNA-Tg＞血清Tg诊断性能最好；如果有甲状腺组织残留，诊断阈值为0.9 ng/ml诊断性能最好，诊断阈值为100 ng/ml时，特异性最高。

因目前Tg的样本留取方法、检测方法尚无统一标准，各实验室检测的Tg浓度可能存在较大差异，因此临床专家和检验专家需仔细评估新引入的FNA-Tg检测设备的性能，并在分化型甲状腺癌患者群体中总结分析最佳诊断阈值和临床决策阈值。

6 FNA-Tg应用的干扰因素

6.1 甲状腺球蛋白抗体 因25% ～ 30%的分化型甲状腺癌患者甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulin antibody，TgAb)检测呈阳性，血清TgAb可以与Tg相互作用，TgAb对FNA-Tg的影响成为既往研究的主题[42]。有研究认为血清TgAb可降低术前可疑淋巴结的FNA-Tg浓度，影响FNA-Tg诊断的准确性，血清TgAb与Tg相互作用，血清TgAb增高，FNA-Tg水平降低[43-44]。然而，Baskin[45]认为外周血中的TgAb不会影响洗脱液中FNA-Tg的测定。其他文献也报道FNA-Tg的诊断性能似乎不受TgAb的影响，在FNA-Tg假阴性的病例中血清TgAb浓度不高[46]。TgAb对FNA-Tg的诊断无干扰的原因可能是：在转移性淋巴结中FNA-Tg浓度远高于洗脱液中存在的TgAb浓度，它可以饱和TgAb结合位点而克服对FNA-Tg的干扰[47]；转移淋巴结内TgAb被洗脱液稀释(1∶50或更高)导致TgAb缺失或浓度降低[48]；细胞内的Tg未暴露于循环中的TgAb，因此不能与循环中的TgAb相互作用[45]。虽然在既往的研究中TgAb是否会对FNA-Tg造成影响尚有争议，但可以在术前常规检测TgAb作为基线值，术后持续随访TgAb，观察其变化趋势，若术后TgAb水平持续升高，应警惕发生复发或转移。

6.2 血清促甲状腺激素和血清Tg 在指南和文献中，血清促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)和血清Tg是否会对FNA-Tg造成影响尚未达成共识。大部分研究认为，甲状腺切除术后甲状腺组织缺失和血清促甲状腺激素抑制可能降低血清Tg和FNA-Tg。血清TSH抑制和血清Tg的存在独立影响FNA-Tg的诊断，血清TSH抑制时FNA-Tg可能存在假阴性，血清Tg存在时FNA-Tg诊断可能存在假阳性。因此建议在TSH刺激后测量FNA-Tg[37]。FNA-Tg诊断阈值的诊断性能因甲状腺状况和血清Tg浓度的不同而不同[41]。然而，也有研究对此提出不同的观点。Borel等[20]认为，即使FNAB采集的样本中包含有血液，FNA-Tg的检测结果也不受血清Tg的影响。他们把患者分为无甲状腺疾病史阴性对照组26例和患有甲状腺结节阳性对照组13例，在阴性对照组中未检测到FNA-Tg，但是可以检测到血清Tg，因此得出结论，FNA-Tg不受血清Tg的影响。上述的诸多研究纳入的样本量较小，所得数据和临床实践可能存在偏差，在未来需要更多的数据进行探索和验证。

7 结语

FNA-Tg在分化型甲状腺癌淋巴结转移诊断中具有重要的应用价值，可以显著提高分化型甲状腺癌患者淋巴结转移诊断的准确性。虽然FNA-Tg被美国ATA指南、NACB指南和欧洲共识强烈推荐，但是其最佳诊断阈值、各种干扰因素对其诊断准确性影响、最佳的检测方法及取样方法尚未达成统一共识，将来有待进一步探索和研究。