腱病动物模型研究进展

张柏青，吴 瑕，李春宝，刘玉杰

1解放军总医院第一医学中心 骨科，北京 100853；2中国质量认证中心，北京 100070

腱病通常指由于肌腱过度的使用和反复牵拉引起的肌腱胶原纤维退行性病变，继发临床症状和病理改变[1-3]。为了研究腱病的发病机制和治疗方法，动物模型必不可少[4-6]。目前用于研究腱病的发病机制和干预治疗的动物模型较少，一部分是采用物理致病因素诱导腱病，另一部分为化学物质注射诱导造模。每种动物模型都有各自的优缺点，但无论哪种模型都存在着与腱病实际临床症状不一致的问题。本文综述并分析了近年来腱病动物模型的研究，以期为进一步研究提供参考。

1 常用腱病动物模型

腱病造模动物目前多为大鼠和兔，其有成本低、容易获得等优点[7-8]。兔与大鼠比较，标本量更大，在进行外科操作时更容易，但其生存能力没有鼠类强，容易死亡，并且进行免疫化学方面检测时可用的试剂盒相对较少，故首选鼠类作为造模动物[9]。诱导造模分为两类，一类是机械过载模型，包括动物跑台、电刺激、直接重复机械牵拉等，其中动物跑台模型最为常用；另一类为化学诱导造模，包括胶原酶、细胞因子、前列腺素、氟喹诺酮、皮质类固醇类等注射模型，其中胶原酶注射模型最为常用[10]。

1.1 动物跑台模型 此为常用腱病造模方法，动物跑台主要在于模仿人类肌腱的过度使用，成功地造出了大鼠冈上肌腱和跟腱的腱病模型[11]。冈上肌腱病模型方法：大鼠在跑台上进行10°的下坡跑，17 m/min，1 h/d，5 d/周。跟腱模型采取10°上坡跑的方式。1周后生物力学检测可以发现肌腱组织的弹性模量及最大应力减少。组织学观察到肌腱组织中细胞增多，胶原蛋白分解，细胞形态学发生变化，肌腱组织横截面面积增大[12]。Cho等[13]研究表明，8周后电镜下肌腱单位面积内胶原纤维密度降低，直径粗大的纤维比例降低，直径细小的纤维比例增加，大鼠肌腱中细胞及糖胺聚糖含量增加，胶原纤维分解，并且表现出不同程度的软骨细胞表型表达。另有研究显示，与兴奋性和凋亡相关的谷氨酸信号和应激反应基因也显著上调，表现为胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)的活性和数量增加[14]。促炎症基因COX-2表达增加，表明炎症微环境下胶原纤维损伤、修复、再损伤的病变过程[15]。

跑台奔跑动物产生周期疲劳，导致腱病的发生[16]。但由于大鼠自身奔跑能力较强，而且很难强迫其进行超强度的运动量，影响成功造模。Kim等[17]通过对大鼠跟腱进行针刺预损伤进行造模，结果显示较单纯机械过载建模时间更短、成功率更高。如何进一步精确量化运动量，如何进一步采取有效的方法让实验动物进行超负荷运动造模，需要进一步的探索研究。因此，进行正式实验前，实验动物都要接受一定量的适应性训练，以便挑选出能够适应和配合实验的动物。此外腱病为反复损伤未能完全愈合导致，一般休息至少2周左右；而动物模型没有休息再损伤的过程，因此不能完全复制临床腱病的病程，并且这种动物造模所需的时间较长[18]。另有文献报道跑台模型造模效果不明确，Huang等[19]研究结果显示，运用跑台造模后，通过几何测量和机械测试分析发现跟腱没有变化。Bell等[20]研究发现适量的运动有助于腱病的愈合。出现这种情况的原因可能在于这两项研究采用了不一样的评估方法[21]。

1.2 胶原酶注射诱导模型 胶原酶注射的腱病模型广泛用于马、兔、鼠的跟腱、髌腱及冈上肌腱等部位。在兔跟腱内注射胶原酶，4周时肌腱周围血管增生和纤维化；16周时观察到肌腱组织黏液样变化，纤维化和胶原束排列混乱及腱细胞的数量也不断增加。有研究显示在第4周时肌腱的横截面积增加，但在16周时并未有明显区别；胶原纤维含量在第4周时下降，在16周时胶原纤维的交联程度增加；最终，肌腱的负载呈下降趋势[22]。另一项研究表明，胶原酶诱导的髌腱损伤模型中可再现腱病的主要特征：血管增多、细胞增多、软骨细胞样变化、周围基质组织的降解、组织修复、细胞外基质失调、蛋白聚糖和胶原蛋白的持续表达类型异常、腱组织中疼痛相关的P物质及降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)表达增加[23]。生物力学显示，在注射胶原酶后，兔和鼠的肌腱抗拉强度下降。另有文献报道了胶原蛋白Ⅲ的表达更高，导致力学性能下降[24]。

一些作者反对注射胶原酶和炎症物质造模，理由是胶原酶和炎症引起的损伤物质与自然产生的物质缺乏相似性。长期过度使用肌腱导致的损伤可能与急性损伤有不同的机制。但实际上，人类腱病的晚期组织病理学检查未发现炎症并不代表早期没有炎症。注射胶原酶第3天检测到白细胞增加，但在第7天后恢复正常[25]。另一方面的质疑在于这种损伤的修复方式与临床上腱病患者的修复方式不一致。受损的细胞外基质和基质成分可以导致肌腱对力刺激及损伤的敏感度更高，“恶性循环”导致腱病[26]。

尽管存在差异，但研究证明了模型再现临床腱病的许多特征，包括基质退化、细胞增多、血管的增加和缺陷的愈合，其伤害的严重程度很容易控制，与跑台相比有着更好可重复性[27]。但胶原酶注射模型产生机制不同于常规腱病，尤其是对腱病进行机制研究时，不适宜作为研究模型。

2 腱病动物模型的病理及生物力学表现

2.1 组织病理学及电镜 腱病组织表现为细胞密度及血管的增加，蛋白多糖等基质的沉积，细胞外基质降解，细胞核变圆以及软骨细胞样改变，腱细胞数量密度增加，但凋亡的数量也增加，偶有脂肪和上皮化生改变和基质金属蛋白酶表达的改变[21,28-29]。细胞外基质的变化可导致肌腱退变，严重时会发生肌腱断裂[8,30]。腱病组织HE染色显示肌腱组织胶原纤维排列紊乱，结构明显破坏，天狼星红染色后在偏振光显微镜下观察示肌腱组织中偏红色的Ⅰ型胶原纤维明显减少，绿黑色的Ⅲ型胶原纤维明显增多，整个胶原基质排列杂乱无章，失去正常肌腱组织结构[21,28-30]。刘春雨等[31]报道腱病组织胶原成分异常，Ⅲ型与Ⅰ型胶原的比例显著高于正常，此外还包括胶原纤维排列紊乱、长度不均、直径减小等组织学表现，新生血管形成增加并内向生长，纤维间糖胺聚糖成分增加，有时还有肌腱钙化的出现。

电镜下观察发现肌腱3周内胶原纤维直径增粗，6周后单位面积内胶原纤维密度降低，直径粗大的纤维比例降低，直径细小的纤维比例增加[13]。腱细胞呈随机散在分布，形态为圆形，细胞核形态破坏，出现凋亡样特征。胶原纤维弥漫性破坏，非胶原细胞外基质替代胶原纤维[32]。

2.2 腱病组织中蛋白聚糖、过氧化物还原酶、基质金属蛋白酶1、胰岛素样生长因子1、骨形态发生蛋白和一氧化氮合成酶基因表达增多，进而导致腱病组织胶原纤维退化，胶原结构排列紊乱[33]。另有研究表明，腱病组织中P物质、CGRP、酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)和 α1-肾上腺素能受体 (α1 adrenergic receptor，α1-AR)、乙酰胆碱 (acetylcholine，ACh)、谷氨酸、COX-2，前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)等疼痛相关神经肽基因表达增多[34-36]。跑台模型中腱细胞内源性表达多种炎症介质，如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素1b(interleukin-1b，IL-1b)、IL-6和IL-10、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)等，导致水肿、充血、缺氧，进而产生自由基，引发慢性肌腱损伤[37]。

肌腱生物力学指标的下降也是评价指标之一。生物力学检测显示刚度、最大载荷、极限强度和弹性模量都下降，Jafari等[12]报道大鼠腱病模型的跟腱极限拉力中值下降了37.7%，刚度中值下降了28.1%。Bell等[20]报道跟腱的最大载荷相对于正常对照组下降了66%。Dan等[38]对大鼠分别进行髌腱建模，结果发现低强度组大鼠髌腱的平均衰竭力为56.8 N，而高强度组则为46.0 N。Longu等[7]报道最大断裂拉力及弹性模量均明显下降。可见肌腱的组织结构改变是肌腱生物力学性能发生变化的物质基础。

3 结语

目前还没有一个完美的腱病动物模型，开发出具有高重复性、稳定性及能够模拟腱病不同病理时期的物理致病模型很有必要。现有研究结果显示没有有效的动物模型能够模拟人类的所有腱病，继续建立各个解剖部位腱病动物模型是很有必要的。在腱病的病理化改变和特点上，跑台模型与胶原酶注射模型具有相似性。腱病为多因素导致肌腱结构功能的累进式紊乱，单一动物模型无法满足腱病各个方面的研究，只能用于研究腱病某一特定的方面。物理腱病模型通常更加适用于对慢性机械负荷导致肌腱紊乱的研究，而化学腱病模型更加适用于有缺陷的愈合过程的研究。为了更好地理解腱病的发病机制，开发新的动物模型，进一步提高造模的可重复性和成功率是今后的研究方向。