血小板保存技术的应用研究进展

刘 磊

血小板是人体血液重要的组成成分，临床输注血小板能有效预防出血或止血、修复血管壁并促进血栓形成，在纠正凝血功能障碍、大失血抢救及外科手术治疗中均发挥着重要作用[1-2]。血小板输注在战时伤病员的止血、预防出血，提高伤病员救治率、生存率上也具有积极的促进意义[3]。随着我国各地区血液管理部门及医疗机构临床合理用血的严密落实，使得成分输血覆盖了大中城市的各级医疗机构。传统的血液资源如全血、红细胞及血浆等得到更充分、合理地使用；同时也导致血小板、冷沉淀及白蛋白等血液制品的需求量显著提高。现阶段我国各地区采供血机构的血小板采集工作普遍存在着诸多困难，短时间内迅速扩张血小板献血员群体难以实现。血小板来源有限，因其储存时间短、储存条件要求高，导致临床用血中出现血小板过期浪费或失效无法使用的情况，也会严重影响患者的及时救治。因此，血小板保存技术的深入研究已逐渐成为全球学者广泛关注的热点项目。本文将对现阶段血小板保存的主要方法与技术手段进行综述。

1 液态储存血小板

1.1室温保存 目前，我国各地区采供血机构及医疗机构的血小板的常规保存条件均为(22±2)°C，振荡保存，有效保存期限仅为5 d。室温下保存过程中血小板的结构与功能会发生一系列改变，又被称为血小板的储存损伤。这些改变主要包括血小板形状由圆盘状可逆地变为球形或分解为碎片状，血小板发生聚集、功能活化，以及糖酵解导致的乳酸浓度升高、pH值降低等代谢变化[4]。血小板储存损伤的发生机制十分复杂，血小板处理过程中采集方法及储存介质、容器的选择、病原体及白细胞的减少均可能对这些改变产生影响。

室温下储存血小板主要依赖血浆或血小板添加剂溶液(platelet additive solution， PAS)与血浆联合作为介质。PAS替代血浆成为血小板保存悬液的主要优势是可将节约的血浆用于临床治疗，有助于临床开展合理用血工作，能有效降低患者输注异体血浆导致的输血不良反应发生风险，提高用血安全。PAS目前已经由初代的PAS-A发展至PAS-G。不同代的PAS主要由不同比例的氯化钠、醋酸钠、枸橼酸钠、氯化钾、氯化镁、磷酸盐、葡萄糖酸钠、葡萄糖、碳酸氢钠等成分组成，这些物质协同发挥抗凝、稳定细胞膜结构、提供代谢底物及缓冲活性、抑制血小板活化等功能[5-6]。研究表明，保存于65%PAS-F和PAS-C的血小板功能与保存于100%血浆中的血小板功能无显著差异[7-8]。PAS应用于血小板储存能有效降低血小板临床输注后过敏反应、非溶血性发热及急性输血反应等不良反应发生率[9-10]。此外，血小板悬浮于PAS中储存时，促使纤维蛋白原等支架蛋白无法贴壁；若存在细菌污染则使其容易在上清液中繁殖，更有助于血小板储存过程中的细菌污染检测[11-12]。新一代PAS的研发能否有效减少或清除血小板中病原体污染值得关注[13]。

1.24℃冷藏保存 20世纪60年代末，Murphy和Gardner[14]指出人体输注4℃冷藏保存的血小板相比于输注22℃振荡保存的血小板在体内有效存活时间大大缩短，可由7～9 d缩短至2～4 d。临床预防性输注血小板要求输注后的血小板在血液循环中尽可能有较长的存活时间，这使得4℃冷藏保存血小板的临床应用受到了广泛质疑。然而，随着血小板临床需求量的增加及相关研究的深入，4℃冷藏保存血小板再次受到越来越多学者的关注。

大量的体内外实验研究表明，冷藏储存血小板相比于室温储存血小板的黏附、聚集功能更佳，更有助于减少出血时间[15]；同时，冷藏储存血小板也能有效减少细菌污染，且无须振荡保存，较室温储存血小板代谢水平更低，乳酸及炎症介质等代谢物质的积累更少[16]。国内文献报道，4℃冷藏保存21 d的悬浮红细胞具有很好的止血功能，这源于悬浮红细胞内残存的血小板有效发挥了凝血功能[17-19]。4℃冷藏保存10～14 d的血小板与22℃振荡保存的血小板相比，其血小板计数、细胞形态、膜及胞质结构比较差异无统计学意义。且4℃冷藏保存血小板具有代谢慢、葡萄糖消耗低、乳酸产生少且pH降低减缓等优势，并具有更佳的聚集、止血功能和血小板活性[20-22]。预防性血小板输注治疗时，室温保存的血小板仍较冷藏保存血小板疗效好，那么，如何将冷藏保存血小板合理应用于临床呢？Montgomery等[23]指出，冷藏血小板具有更强的聚集功能，用于急性出血或低血容量休克抢救时能有效控制活动性出血；相比于室温保存血小板更有助于血栓迅速形成，从而发挥凝血、止血的功能。血小板临床输注治疗时，可结合患者的实际情况，使用冷藏储存血小板与室温储存血小板。活动性出血患者更多地使用冷藏储存血小板，不仅更有助于止血，也可延长血小板的保存时间至10～14 d。预防性输注治疗的患者则使用室温储存血小板，可有效提高血小板在外周血中存活时间，更好地发挥预防出血的作用。现阶段我国尚且空缺4℃冷藏保存血小板的技术规范与应用指南，应尽快制定相应的政策、指南与规范，推动4℃冷藏保存血小板技术的深入研究，对减少血液资源浪费、充分合理应用血小板资源、提高临床救治能力十分必要也迫在眉睫。

2 冰冻保存血小板

二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide， DMSO)冰冻保存血小板的方法最早在20世纪70年代由美国海军研制，是将血小板悬液中加入DMSO进行冰冻保存，使用时先解冻除去DMSO[24]。在解冻前除去大部分DMSO能省去许多解冻后的操作程序，具有能减少设备使用和人员培训的显著优势[25]。体内外实验结果均证实，冰冻保存血小板解冻后能发挥一定功能，较液态储存血小板与凝血因子V具有更高的结合能力，并在ADP刺激后能够产生更多的血栓素A2[26-27]。一项纳入32名志愿者的临床试验结果显示，分别输注冰冻保存血小板和液态储存血小板24 h后，血液循环中冰冻保存的血小板含量显著少于液态储存的血小板含量，但二者在外周血中持续存活的时间仅有微小差别[28]。

目前，关于冰冻血小板应用于活动性出血的临床研究报道仍然较少。一项前瞻性临床随机对照试验结果表明，在心脏手术后需要进行输血治疗的患者中，24例输注冰冻保存血小板患者的出血量显著少于29例输注液态储存血小板患者的出血量；但输注冰冻保存血小板后患者的血小板增量总体表现更低，且血小板在体内存活的趋势也不够理想[29]。因此推测冰冻血小板具有更佳止血功效的机制是血小板在解冻过程中已经发生了“预激活”，这使得血小板在输注后能迅速地与血管内皮细胞结合发挥止血作用，而体外实验中冰冻保存血小板与凝血因子V具有更强的结合能力，从而在ADP刺激后产生更多的血栓素A2增强促凝活性也有力支撑这一假设。

现阶段冰冻保存血小板的临床应用仍然面临诸多难题，如尚且缺乏大样本量、中长期的临床研究来证实冰冻血小板应用的可行性及安全性。有学者担忧冰冻保存血小板输注后尽管能够促进凝血，但形成的血栓很可能较为脆弱，容易增加后期出血的概率。输注冰冻血小板若在治疗后期导致血液处于高凝状态，则会引发血栓性疾病，但目前的临床研究还无法进行有效评估。人们熟知DMSO具有神经毒性、肾毒性及心脏毒性，尽管冰冻血小板中DMSO的含量远低于1.0 g/kg的毒性剂量，但长期大量冰冻血小板的输注安全性仍然有待深入研究。

3 冷冻干燥保存血小板

由于冻干制品能够常温下保存、性能稳定且便于运输，使得冷冻干燥技术愈来愈广泛地应用于各种生物材料和制品的保存，并且已经在某些血液产品、疫苗领域取得了良好的效果[30-31]。20世纪50年代就有学者开始着手进行冻干血小板的研究，但经冻干处理后的血小板却失去了原有的生物学活性[32]。近年来随着冷冻干燥技艺的不断进步与发展，临床救治中对血小板需求的增加及战时及非战争军事行动中的血液保障能力要求的提高，使得国内外越来越多的学者开始关注冻干血小板的研究。

研究表明，冻干血小板复水化后几乎保持着正常的形态，并具有良好的黏附性，但血小板聚集与活化功能均受到不同程度地损伤[33-34]。相比于新鲜血小板，复水化后的冻干血小板激活后仅能产生少量的血栓素和P-选择素，且具有一定的促凝作用[35]。由于复水化过程中血小板的活化，从而导致GPⅡb-Ⅲa表达量仅相当于新鲜血小板的1/2，并且在冻干血小板活化后GPⅡb-Ⅲa表达量也无显著增加[36-37]。纤维蛋白原可以通过GPⅡb-Ⅲa结合至复水化后的冻干血小板，但其亲和力也仅相当于新鲜血小板的1/2[34,38]。

动物模型实验已经证实了冻干血小板复水化后在体内具有一定的止血作用[39-40]。利用荧光标记示踪法可定位冻干血小板复水化后在犬类血管损伤部位聚集并发挥促进血栓形成的作用[33]。37只活动性出血的犬类分别输注新鲜血小板与冻干血小板治疗，结果显示二者对于犬类血小板的增量、存活率以及输血不良反应发生情况均无显著差异[41]。有报道指出，包括冻干血小板复水化后黏附完整的血管内皮细胞的能力大大降低[42]，且会在血液循环中由IgG介导的巨噬细胞吞噬下被迅速清除[43]。这提示尽管冻干血小板技术的研究取得了一定进展，但仍然存在四个方面难题需要攻破：冻干血小板保护剂和添加剂的选择和优化；血小板冻干过程中冻干参数的设置和优化；血小板冻干后复水方式的研究；大容量冻干血小板技术的研发。

近年来国内外学者提出，在血小板冻干前预处理中通过负载海藻糖能够有效提高血小板对渗透压的耐受性，经过预处理的血小板经冷冻干燥并复水化后，其血小板恢复率高达80%；与新鲜血小板相比，具有相近的促血凝块形成时间，最大聚集率以及聚集速率分别达新鲜血小板的80%和40%，且平均血小板体积有所增大，约40%的血小板细胞能表达P-选择素以及GPⅡb-Ⅲa[44-45]。对于血小板的聚集功能仍然损伤较大，且冻干前一系列处理过程不可避免地会造成血小板的提前激活，导致血小板功能的降低甚至丧失。因此有学者开始在冻干血小板的预处理液中加入一些血小板抑制剂[46-48]，通过不断地优化预处理液配方来最大程度减少血小板冻干前以及冻干过程中造成的损伤。

4 结语和展望

随着医疗技术的不断进步及临床对血液制品需求的日益提高，血小板保存技术的难题已经成为限制临床输血救治工作的瓶颈，如何继续深入开展血小板保存技术的研究，将已有的技术及时的转化为临床应用，并制定相应的技术规范与应用指南是我们广大输血医学工作者值得思考并亟待解决的问题。室温保存血小板在临床预防性输注中能够显著延长血小板的体内存活时间；4°C冷藏保存血小板在急性创伤性出血中能够有效发挥止血作用；冷冻血小板能够有效解决特殊表型血小板血液制品供应难题；冻干保存血小板能显著提高我军战时及非战争军事行动中的伤病员救治能力。充分认识到上述每项技术的独特优势并予以合理应用，同时针对性地加强血小板保存技术的深入研究，对于提高我国临床输血救治能力，我军战时及非战争军事行动中的血液保障能力意义重大。