诱导多能干细胞对肛瘘治疗的研究

★ 朱彩丽 肖慧荣 谢昌营 吴成成 廖武 毛源婷 胡宇（.江西中医药大学研究生院 南昌 330004；.江西中医药大学附属医院 南昌 330006）

长期以来如何在肛瘘的治愈率和失禁率之间找到一个平衡，一直是肛肠外科医生面临的棘手问题。国内医生为了获得较高的治愈率往往过多的损伤到括约肌，因此伴随着出现较高的失禁率。国外医生则一味注重保护肛门功能，所以常常只得到极低的治愈率。如何在提高治愈率的同时尽量保护括约肌，是我们必须研究的问题。随着生活质量的提高，微创治疗应该成为我们提倡的理念，其中干细胞疗法有望成为就是未来最有潜力的疗法之一。虽然还未见有文献记载用IPS 细胞治疗肛瘘，但IPS 细胞有着所有干细胞一样的“干性”。通过干细胞的特性及其促进创面愈合的机制，可以推理IPS 细胞理论上可以用于肛瘘治疗，并且其来源广泛、取材方便、突破了伦理的禁锢，也不会引起自身免疫抑制反应。因此本文就IPS 细胞治疗肛瘘展开研究。

1 资料和方法

1.1 资料来源 由第一作者检索PubMed 及中国知网、万方数据库等数据库，中文检索词为“干细胞，诱导多能干细胞，肛瘘，创面愈合”；英文检 索 词 为“stem cells，IPSC，anal fistula，wound healing”。以2005 至2018 年间文献为主。检索文献类型：综述性文献、著作、研究性临床报道等。

1.2 文献的纳入标准 ①与IPS 细胞研究现状相关的文献；②与干细胞促进创面愈合有关的文献；③各种术式治疗肛瘘的研究现状；④干细胞移植治疗肛瘘的相关文献；⑤同一研究领域近期发表的文章。

1.3 文献的排除标准 排除与文章研究目的无关的文献，排除重复性研究文献，排除表述观念陈旧性文献，排除时间过早文献，共纳入符合筛选标准的30 余篇文献进行归纳总结。

2 干细胞和诱导多能干细胞

2.1 概念及分类 干细胞，医学界称之为“万用细胞”，是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，在一定条件下，可分化出各类功能细胞，具有再生出各种组织器官的潜能。根据它所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据其的发育潜能可分为：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞（又称专能干细胞）。2006 年Takahashi 等［1］将4 个基因导入到小鼠成纤维细胞，使后者成为具有胚胎干细胞样特性的细胞，即诱导多能干细胞（IPSC），为种子细胞的研究开辟了第二战场。

2.2 IPS 细胞的发现和发展 2006 年，日本京都大学Shinya Yamanaka 实验室发现了本世纪干细胞领域最振奋人心的研究之一——诱导多能干细胞，采用4 个转录因子——Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc成功地完成体细胞向IPSC 的重编程［1］。这一发现解决了临床干细胞来源和伦理禁锢的难题，可以建立病人特异性iPSC 及个性化治疗，开辟了再生医学和重编程的全新领域。Yamanaka 也因此与JohnGurdon 共享了2012 年的诺贝尔生理学与医学奖。2007 年，Yamanaka 和Thomson 实 验 室 分 别成功建立了人的IPSC［2-3］。同年，麻省理工学院Jaenisch 实验室将IPSC 技术用于镰刀型贫血小鼠模型的治疗上，提出利用 IPSC 治疗单基因遗传疾病的观点［4］。2009 年，同济大学高绍荣课题组将这一策略应用于地中海贫血症患者来源的细胞，获得病人特异性功能恢复的造血细胞［5］。同年，周琪院士和高绍荣教授两个课题组同时发表独立研究，通过四倍体胚胎互补得到了由iPS 细胞来源的iPS小鼠，证明iPSC 能够具备完全多能性，打破了对iPSC 质量的质疑，使iPS 技术的发展更进一步，该项贡献被美国TIMES 杂志评为2009 年世界十大医学突破之一［6-7］。此后，大量工作报道了利用IPS技术获得病人特异性多能性细胞，可应用于单基因遗传病模型的治疗和患者特异性病理筛查。2010年，裴端卿课题组首次发现维生素C 可以大幅提高IPSC 的诱导成功率［8］，该方法受到国际广泛认可和应用。2013 年，北京大学邓宏魁课题组成功实现了完全利用小分子化合物完成小鼠体细胞向IPSC 的重编程，实现了IPS 技术的革命性突破［9］。虽然IPS 技术尚未完全成熟，但基于IPSC 未来在临床上大量应用的预期，中国与日本、英国都开始建立临床级的人IPS 细胞库，以期在技术和政策成熟后，获得迅速广泛的临床应用。

2.3 IPS 的应用 目前，IPS 主要被应用于再生医学、药物研发及人类疾病模型等领域。

2.3.1 再生医学 骨髓移植是干细胞治疗疾病最早的临床应用，且成为根治白血病的主要手段。器官移植和细胞治疗过程中存在的一个最大难题就是免疫排斥反应，长期使用免疫抑制剂会产生很多不良反应。患者特异性的IPSC 就不存在免疫排斥现象。Hanna 等［4］利用小鼠模型证实IPSC 可以治疗镰刀状细胞贫血病，通过对小鼠模型的IPSC 进行基因打靶可以修复由疾病引起的突变，修复的IPSC 可以分化成造血干细胞。把这些健康的造血干细胞移植到贫血小鼠体内，进行增殖、产生正常的红细胞，这样就能达到治疗该疾病的目的。

2.3.2 药物研发 以往，研究者通常用小鼠、狗和猪等动物对药物的治疗效果和不良反应进行测试，但人和动物毕竟存在差异。如今，我们可以通过患者特异性IPSC 得到疾病模型对新药物进行有效测试。目前有些药物已经在多种患者特异性IPSC疾病模型中通过了测试，如对脊髓性肌萎缩、家族性自主神经功能异常等具有良好治疗效果的药物。研究表明，如该药物对患者特异性iPS 建立的疾病模型能起作用，说明了它具有很大的治疗潜力。

2.3.3 疾病模型 人类遗传疾病研究的主要问题是实验材料来源的问题，可以通过获取病人体细胞重编程为具有相同基因的IPS 细胞进而建立特定的疾病模型来解决这一问题。通过患者特异性IPSC已经建立了多种人类疾病模型，其中包括帕金森病、地中海贫血、1 型糖尿病、唐氏综合征等。由病人特异性IPSC 建立的疾病模型有助于探索该疾病的发病机制。

2.4 IPS 细胞来源 对IPS 细胞来源进行研究时发现，不同分化程度、不同组织来源的细胞均可被重编程为IPS 细胞。理论上任何一种细胞都可以被诱导重编程为IPS 细胞。第一代IPS 细胞来源于小鼠皮肤成纤维细胞。2007 年，Yamanaka 研究小组成功建立了人IPSC 细胞系，这使得建立患者疾病特异的多能干细胞成为可能，IPS 技术向临床应用迈出了重要的一步［10-11］。目前，除皮肤成纤维细胞外，脂肪干细胞、羊水细胞、角质细胞、外周血细胞等已被证实都能重编程为IPSC 细胞［12-15］。值得一提的是，外周血细胞及从尿液中分离的肾小管上皮细胞也可以作为细胞来源［16］，这为临床取材提供了极大的便利。

3 肛瘘

3.1 肛瘘的定义及分类 肛瘘是临床上常见的肛门直肠疾病，是肛周脓肿破溃或者切口引流引发的后遗病变，肛瘘和脓肿是一个疾病的两个阶段。在国内，大多医院医生习惯使用我国经典的高位肛瘘、低位肛瘘、复杂肛瘘和简单肛瘘的分类。在国外的临床和文献中则主要使用Parks 分类［17］，是根据瘘管与肛门括约肌的关系把肛瘘分成4 类，即括约肌间肛瘘、经括约肌肛瘘、括约肌外肛瘘和括约肌上肛瘘。

3.2 肛瘘国内外治疗现状 对于肛瘘全球还缺乏一套“金标准”术式，目前国内外肛瘘手术治疗现状：复杂性肛瘘主要采用的手术治疗方式有肛瘘切开挂线术和（或）分期肛瘘切开术、括约肌间瘘管结扎术（LIFT）、肛瘘栓填塞术、括约肌间瘘管结扎术+肛瘘栓填塞术（LIFT-plug 术）、直肠黏膜推移皮瓣术、隧道式支管拖线术以及纤维蛋白胶注射术等10 余种手术方式［18-20］。以肛瘘切开挂线术为代表的传统手术，虽然手术治愈率高，但手术肛门括约肌损伤严重，术后大便失禁发生率高；手术创面大，伤口愈合时间长，疼痛剧烈；给患者带来很大的心理及经济负担［21-23］。2015 年的一项多中心回顾性研究报道537 例患有低位瘘管（少于括约肌复合体的1/3）的患者，瘘管切开术后5 年的愈合率为81%，26.8%的患者有严重失禁，只有26.3%的患者生活质量与正常人相当［24］。RitChie等［25］报道切割挂线术后的平均失禁率为12%。

4 干细胞与肛瘘

4.1 干细胞促进伤口愈合的机制 组织创面愈合是涉及控制炎症、上皮形成、新血管生成、增殖和胶原基质形成的复杂过程［26-27］。干细胞可通过诱导分化、调节炎症免疫、促进血管新生、激活成纤维细胞等一系列机制促进创面的愈合。Rodriguez等［28］在小鼠皮肤伤口皮下注射ADSCs，通过愈合后的皮肤免疫组织化学和血液灌注分析发现，与自愈组相比，ADSCs 治疗组创面愈合更快。

4.2 脂肪干细胞治疗肛瘘的成果 文献报道脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）用于肛腺感染性肛瘘、克罗恩肛瘘、直肠阴道瘘、炎症性肠病等相关的复杂性肛瘘均取得了较好的疗效［29-31］。2003 年Gar Ciaolmo 等［32］学者报道了临床上首例使用ADSCs 治疗炎症性肠病相关的克罗恩肛瘘，该患者，33 岁女性，患有克罗恩病11 年，因肛周脓肿术后形成直肠阴道瘘；使用肿瘤坏死因子α 单抗和挂线引流术后症状没有改善，局部注射9×106 自体ADSCs 治疗1 周后，手术伤口完全闭合，仅留有轻微的炎症症状，无大便失禁或阴道出血，3 个月内疾病未复发。此后，Julián 等［33］采用扩增异体脂肪来源的间充质干细胞（Cx601）治疗复杂性肛瘘，用随机，双盲，平行，对照的方法，入组了伴有难治性复杂性和做过外科引流术的成年CD 病人，对照组予以局部病灶单次注射24mL 生理盐水，治疗组注射1×109的Cx601 细胞，结果显示Cx601 对传统治疗、生物治疗或两者联合治疗无应答的复杂性肛瘘是安全且有效的治疗方法。

4.3 IPS 细胞治疗肛瘘的可行性及优势 IPS 细胞有着所有干细胞一样的干性，能通过多种机制促进创面愈合，且取材比脂肪干细胞更方便，因此将IPS 细胞应用于肛瘘治疗有可行性也有必要性。具体操作：定位瘘管及内口→清除瘘管内坏死组织→用细胞刷将瘘管内壁清理干净→注入IPS 细胞混悬→缝扎封闭内口→注入封闭剂封闭瘘管→缝扎封闭内外口。相比传统治疗方法，IPS 细胞疗法具有无肛门括约肌损伤、不影响二次手术、创伤小、愈合时间快、住院时间短、病人痛苦小等优势。

4.4 存在的问题 尽管IPS 细胞治疗肛瘘的优势显而易见，但其存在的一些问题也不容忽视：①IPS 干细胞取自病人自体细胞，特异性高，针对性强，属一对一，这样导致临床制剂不能大批量生产，甚至需要提前预定，制作需要一定时间；②目前的技术水平下，IPS 细胞重编程的成功率还不是很高；③干细胞疗法不同于其他治疗方法，其制备严谨，对工作人员专业要求高；④目前虽然没有报道临床干细胞治疗增加致瘤风险，但建议在临床治疗前，需对IPS 干细胞进行体内外的致瘤分析；⑤IPS 细胞技术含量高，费用相对也高。

5 总结

IPS 细胞是再生医学领域里程碑式的发现，已在各专科疾病中发挥作用。肛瘘是困扰病人的常见肛肠疾病，一直未找到平衡治愈率和失禁率的理想治疗方法。将IPS 细胞疗法应用于肛瘘治疗，联合其他方法或是同新型生物材料结合以提高肛瘘治愈率，将成为肛瘘治疗研究的新方向。