TLR5基因多态性与非贲门胃癌的关联研究

高 芳，卫星如，马立聪，，田旭阳，党 彤，贾彦彬,,4

在全球范围内，胃癌(gastric cancer, GC)仍是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。2015年，国家癌症中心统计数据显示，我国GC每年新发病例约67.9万例，其发病率在恶性肿瘤中高居第2位[1]；且每年GC新发病例占世界GC总人数的47%，大部分患者就诊时已为局部晚期或进展期，5年生存率为28%[2]，形势十分严峻。GC已是我国公民最主要的疾病负担，如何对GC进行有效防治是我们面临的一个公共卫生问题。

近年来，Toll样受体家族(toll-like receptors，TLRs)被发现是一种受体蛋白，在抗病原微生物免疫防御反应中起重要作用，与多种胃黏膜疾病的发生、发展有着密切的联系[3]。目前，人们普遍认为GC的发生与环境、幽门螺杆菌感染等因素密切相关。一些单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与胃癌变的遗传易感性关联[4]，提示在GC的发病过程中，遗传因素起非常重要的作用[5]。此外，TLR5由于可识别幽门螺杆菌的鞭毛蛋白，与GC的易感性相关[6]。现在中国包头地区汉族人群中，探讨TLR5基因多态性与非贲门胃癌的相关性，旨在为非贲门胃癌的早期诊断和治疗提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料选取2008年9月～2010年6月间包头市肿瘤医院经组织病理学诊断为非贲门胃癌的288例患者为病例组。所有患者均为新发病例且未接受过放化疗。其中男性224例，女性64例，年龄26～83(59.48±11.23)岁。选取同期281例社区体检人群作为对照组，其中男性220例，女性61例，年龄26～85(59.10±11.57)岁；正常对照均无癌症病史和明显的胃部疾病。病例组和对照组在年龄和性别方面相匹配(年龄：t=0.40,P=0.69；性别：χ2=0.02,P=0.88)[7]。569例研究样本均为汉族，相互之间无血缘关系且在包头居住5年以上，均签署了知情同意书。本研究已获得包头医学院伦理学委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1Tag-SNPs的筛选 根据HapMap数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov)中中国人的数据，使用Agorithm-Tagger-pairwise Tagging软件筛选基因的tagSNPs (参数设定为MAF>5%、r2>0.8)。筛选范围包括TLR5基因第一个外显子上游20 kb和最后一个外显子下游10 kb的序列，最终初步筛选出4个SNPs，即rs34270714、 rs5744174、rs851139、rs17163737进行研究。

1.2.2基因分型 抽取所有研究对象静脉血3 ml，用DNA提取试剂盒(北京天根公司)提取外周血白细胞中的DNA，用TaqMan法对4 个SNP进行基因分型。引物、FAM和VIC标记探针由Applied Biosystems公司(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)设计并合成，实验设阴性和阳性对照，实验操作严格按照说明书进行。基因分型在北京诺赛基因组有限公司完成，4 个SNP基因分型的成功率均大于98%。

1.3 统计学处理采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析。在对照组中用χ2检验来检测基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；采用t检验比较分析年龄在病例组及对照组间的分布差异；采用χ2检验比较性别在病例组和对照组的分布差异。用Haploview 4.0软件构建单体型。用非条件性Logistic回归计算比值比(odds ratio,OR)及其95%可信区间(confidence interval,CI)，评估各等位基因、基因型以及单体型与非贲门胃癌的发病风险是否存在关联，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各SNP位点等位基因与非贲门胃癌发病风险的关系通过对两组人群TLR5基因SNP rs34270714、rs5744174、rs851139、rs17163737位点的等位基因进行分析，结果显示4个位点的SNP均与非贲门胃癌的发病风险没有关联(P>0.05)。见表1。

表1 各SNP位点等位基因与非贲门胃癌的关系[n(%)]

*由于有缺失的数据，因此，列之和不及样本的等位基因总数；#平衡了性别和年龄因素

2.2 各SNP位点基因型与非贲门胃癌发生的关系在正常对照中，SNP rs34270714、rs5744174、rs851139、rs17163737的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。SNP rs17163737与非贲门胃癌的发病风险相关联，与携带GG基因型的人群比较，GT基因型携带者非贲门胃癌的发病风险可提高1.605倍(GTvsGG:OR=1.605, 95%CI=1.131～2.280)，其余SNP与非贲门胃癌发病风险无关联(P>0.05)。见表2。

表2 各SNP位点基因型与非贲门胃癌的关联分析[n(%)]

*由于有缺失的数据，因此，列之和不及样本总数；#平衡了性别和年龄因素

2.3 TLR5基因的单体型与非贲门胃癌发生的关系对TLR5基因的4个SNP进行连锁不平衡分析，结果显示：rs5744174-rs851139 -rs17163737存在强连锁不平衡，构成单体型区域(Block)；然而各单体型与非贲门胃癌发病风险无关联。见表3。

表3 TLR5基因单体型与非贲门胃癌的关系(%)

*SNP顺序为rs5744174-rs851139-rs17163737

3 讨论

GC是一种受多因素影响、发病机制复杂的癌症，虽然在临床治疗及基础研究中取得了一些进展，但GC的发生发展机制还没有完全阐明[8]。研究显示TLR5在正常胃上皮细胞的顶部和基底外侧特异性表达，可识别细菌鞭毛蛋白，但感染幽门螺旋杆菌后，顶部表达就消失了。Lagunes-Servin et al[9]发现TLR5与幽门螺杆菌感染密切相关。也有研究显示幽门螺旋杆菌可通过避开TLR5而逃避免疫系统的监测[10-11]。这些结果提示，TLR5基因可能与幽门螺旋杆菌感染以及其导致的GC的发生有关，是研究GC发病风险的重要的候选基因。

TLR5基因位于染色体1q41，包含6个外显子。TLR5功能异常与GC、宫颈癌、子宫内膜癌和卵巢癌的发生有关[12]。Zeng et al[13]发现TLR5遗传变异和幽门螺杆菌感染之间的交互作用与GC的发病风险关联。Xu et al[6]的研究显示，TLR5 基因多态性与GC风险显著关联。然而，非贲门胃癌和贲门癌在病因、病理、癌变以及预后等方面都存在较大差异[14]。因此，为了保证样本的均质性，本研究将病例限定为非贲门胃癌的患者。

本研究以中国包头汉族人群为样本，检测了TLR5基因多态性与非贲门胃癌遗传易感性的关系。研究结果显示：包头地区汉族人群中TLR5基因SNP rs17163737与非贲门胃癌的发病风险相关联，与携带GG基因型的人群比较，GT基因型携带者非贲门胃癌的发病风险可提高1.605倍(GTvsGG:OR=1.605, 95%CI=1.131～2.280)，SNP rs34270714、rs5744174、rs851139与非贲门胃癌发病风险没有关联(P>0.05)。同时我们的研究显示：rs5744174-rs851139 -rs17163737存在强连锁不平衡，构成单体型区域，然而各单体型与非贲门胃癌发病风险无关联。Xu et al[6]收集了1 300例GC患者和1 300例正常对照，并探讨了TLR5基因SNP rs5744174和rs17163737与GC遗传易感性的关系。结果显示rs5744174、rs17163737与GC的发病风险相关联，其中与TT基因型相比，rs5744174 CC基因型可增加GC的发病风险；与GG基因型携带者相比，携带rs17163737 GT和TT基因型者GC的发病风险上升。我们的研究结果与Xu et al[6]的不太一致，可能的原因为：①两项研究样本的遗传亚结构不同，我们的样本是中国西北部包头市的汉族人群，而他们的样本主要来自中国南方地区；②两项研究病例的选择标准有差异，我们研究的病例限定为非贲门胃癌患者，而Xu et al[6]的研究病例没有如此限定；③我们的样本量偏低，可能导致了结果的差异。

本研究我们筛选4个tagSNPs rs34270714、rs5744174、rs851139、rs17163737，进行了初步探讨，在今后的研究中我们将继续筛选位于外显子区和其他非编码区的SNP进行证实，同时扩大样本量继续深入地研究。