葡萄糖醛酸功能化双介孔硅对胆红素的高效吸附研究*

肖文香，张萌汇，邓聪敏，刘子卓，李 华

(1. 桂林电子科技大学 生命与环境科学学院，广西 桂林 541004；2. 广西自动检测技术与仪器重点实验室，广西 桂林 541004)

0 引 言

胆红素是由血红蛋白分解代谢产生的一种生物活性物质。健康成年人体内每天约产生250～300 mg胆红素，新生儿胆红素的产生量更高[1]。血液胆红素浓度过高会引发肝、胆机能失调，对神经系统和大脑造成永久性的损伤[2]。如何高效、及时地去除血液内过量的游离胆红素是临床上治疗高胆红素血症的核心和关键。基于吸附原理的血液灌流疗法是清除胆红素的有效方法之一[3]，其疗效取决于吸附剂的性能。关于胆红素吸附剂，围绕着如何提高吸附量、改善材料的生物相容性等方面，开展了很多研究工作。

传统的胆红素吸附剂材料为活性炭、树脂等，纳米材料在吸附剂领域表现出良好的应用潜力[4-8]。介孔硅具有粒径、孔道可控及比表面积大、生物相容性好等特点，因而是一类高效的胆红素吸附剂。为了增强介孔硅对胆红素的吸附量及吸附选择性，通常对介孔硅进行功能化，以引入能与胆红素结合的特定功能基团，如氨基[9]、牛血清白蛋白(BSA)[10]、氨基酸[11]、含胍聚合物[12]等。

以上介孔硅胆红素吸附剂存在的缺点是吸附平衡时间长(>1 h),吸附量不高(<100 mg/g)。为了加快吸附速率，采用具有小孔径和较大孔径两种介孔孔道的双介孔硅作为吸附剂，大孔径介孔孔道能促进胆红素在孔道扩散，从而缩短吸附平衡时间。通过在双介孔硅中引入葡萄糖醛酸基团，达到提高胆红素吸附量和选择性吸附的目的。葡萄糖醛酸是葡萄糖的一种衍生物，在肝脏中，游离胆红素在葡萄糖醛酸转移酶的作用下与葡萄糖醛酸结合，生成水溶性的直接胆红素进而被肝脏代谢，说明胆红素与葡萄糖醛酸之间具有较好的相互作用。模拟该生理过程，采用葡萄糖醛酸对双介孔硅进行功能化，这也是提高材料水溶性、生物相容性的有效手段[13]。同时由于葡萄糖醛酸不是蛋白质的结合位点,当胆红素与血清蛋白共存时，增强了吸附剂对胆红素的吸附选择性[14]。葡萄糖醛酸功能化双介孔硅实现了对胆红素的快速、选择性吸附。

1 实 验

1.1 仪器和试剂

硅酸钠、乙酸乙酯、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、胆红素、D-葡萄糖醛酸、(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)等试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。

实验中用到的主要仪器有集热式磁力搅拌器(上海力辰)、UH5300紫外可见分光光度计(Hitachi)、H-800透射电镜(TEM，加速电压200 kV)、X射线衍射仪( Philip X′pert pro)、傅里叶变换红外光谱仪 (FTIR, Thermo Nicolet NEXUS 670)、N2吸附分析仪(Quantachrome Autosorb iQ2)。

1.2 吸附剂的制备

双介孔硅(BMS)参照文献制备[15]。采用乙酸乙酯的水解来控制合成溶液的pH值。合成反应在能耐受压力的聚丙烯反应釜中进行，温度约为30 ℃。将19.6 g的CTMAB完全溶解在350 mL的二次蒸馏水中，再加入10 g的Na2SiO3固体，搅拌，得到澄清溶液。在搅拌作用下，向溶液中迅速加入35 mL的乙酸乙酯，30 s后停止搅拌,最终反应物的摩尔比为n(Na2-SiO3)∶n(CTMAB)∶n(H2O)∶n(乙酸乙酯)=1∶0.66∶237∶4.36。混合溶液在室温下放置5 h后，将溶液置于90 ℃保温50 h。老化完成后，趁溶液还温热时过滤，得到的固体依次用蒸馏水、无水乙醇充分洗涤，60 ℃真空干燥，最后于600 ℃在空气气氛中灼烧20 h，以除去模板剂。

将1 g的双介孔硅与4 mL的浓氨水(28%质量分数)超声15 min，加入300 mL无水乙醇、2 mL APTES，再超声30 min，室温剧烈搅拌反应3 h，过滤，用无水乙醇洗涤，得到氨基化双介孔硅(NH2-BMS)。

将D-葡萄糖醛酸(0.3 g)、EDC(0.3 g)和NHS(0.45 g)溶于300 mL的蒸馏水，37 ℃活化15 min，再加入1 g氨基化双介孔硅，室温下搅拌过夜。之后过滤、蒸馏水洗涤，60 ℃真空干燥，得到淡黄色的葡萄糖醛酸功能化双介孔硅(Glu-BMS)。

1.3 葡萄糖醛酸功能化双介孔硅对胆红素的吸附

胆红素固体先用少许0.02 mol/L NaOH溶液溶解，用0.1 mol/L HCl调节溶液pH值至近中性，再用10 mmol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释，得到相应浓度的胆红素溶液，4 ℃避光保存。由于胆红素溶液见光容易氧化变质，因此在溶液配制过程中应注意避光操作。

吸附实验采用批实验法在避光条件下进行，将4 mL胆红素溶液和5 mg吸附剂混合，在一定温度下恒温振荡(100 r/min)一定时间后，用0.45 μm膜过滤器过滤，测定438 nm处滤液的吸光度，根据标准曲线计算出胆红素的浓度，平行测定3次，并按式(1)计算吸附量Q

(1)

式中Q为吸附量(mg/g)，C0与C为吸附前后胆红素的浓度(mg/mL),m为吸附剂的质量(g)。以不加吸附剂的胆红素溶液作为空白对照，扣除空白值后，得到吸附剂的实际吸附量。

2 结果与讨论

2.1 吸附剂的表征

介孔硅具有均匀的孔道和较大的比表面积，因而具有良好的吸附性能。为了加快传质速率，提高吸附剂对胆红素的吸附速度，因而选用具有介孔及较大孔道的双介孔硅作为目标吸附剂。从图1TEM图可知，制备得到的双介孔硅为球形颗粒，颗粒直径约为200 nm，从颗粒的边缘部分可以明显看出其纳米孔结构。小角XRD谱显示，双介孔硅具有一定的MCM-41相成分，谱峰较宽，表明介孔硅孔壁晶化程度不高；葡萄糖醛酸功能化前后双介孔硅XRD峰基本不变，说明功能化对介孔硅的结构影响不大。

图1 双介孔硅的TEM图(a)和XRD图(b)Fig 1 TEM image and XRD spectra of the adsorbents

图2 N2吸附等温线(a)与FT-IR图(b)Fig 2 N2 adsorption-desorption isotherms and FT-IR spectra of the adsorbents

表1 吸附剂参数.Table 1 Physical parameters of the adsorbents

2.2 葡萄糖醛酸化双介孔硅对胆红素的吸附

2.2.1 吸附时间对胆红素吸附的影响

将5 mg的Glu-BMS吸附剂加入4 mL 0.1 mg/mL胆红素溶液中，准备8份同样的样品，23 ℃恒温振荡，当吸附时间分别5、7、10、15、20、30、50和70 min时，取出一个样品，过滤，测定胆红素溶液浓度，计算吸附量，结果如图3(a)所示。当吸附时间小于10 min时，随着吸附时间延长，Glu-BMS、BMS对胆红素的吸附急剧增加，吸附平衡时间分别为15和10 min。与BMS相比，Glu-BMS的吸附平衡时间变长了，原因在于经过葡萄糖醛酸功能化之后，介孔的孔径与孔容积减小(表1)，胆红素的传质速度有所降低所致。仅仅具备单一孔道的介孔硅胆红素吸附剂，其吸附平衡时间一般都大于1 h[9-12]，由此可见双介孔孔道的引入，显著缩短了吸附剂对胆红素的吸附平衡时间。

2.2.2 温度对胆红素吸附的影响

温度会影响吸附剂与胆红素之间的相互作用，将样品在一定温度下恒温振荡吸附15 min，结果如图3(b)所示。在20～42 ℃温度范围内，随着温度升高，BMS和Glu-BMS的吸附量均增大。BMS中的Si—OH和Glu-BMS中葡萄糖醛酸基团中的-OH可与胆红素的—COOH、—NH—基团形成氢键而被吸附，当吸附温度升高时，胆红素向介孔孔道的扩散速度加快，形成氢键的数量增加，因而吸附量增大。温度继续升高，氢键被破坏，吸附量降低。Glu-BMS吸附剂的温度适用范围宽，在 20～42 ℃范围内，温度变化所引起的吸附量误差小于5%。

图3 吸附时间(a)和温度(b)对胆红素吸附的影响Fig 3 Effect of time and temperature on bilirubin adsorption

2.2.3 初始浓度对胆红素吸附的影响

为了确定吸附剂的饱和吸附量，吸附剂加入量不变，改变胆红素溶液的初始浓度，在37 ℃吸附15 min，吸附量如图4(a)所示。当胆红素初始浓度较低时(C0<0.3 mg/mL), 两种吸附剂的吸附量与浓度成线性关系；当C0>0.3 mg/mL时，浓度增大，吸附量基本不变，说明吸附剂已达到吸附饱和。Glu-BMS与BMS的饱和吸附量分别为(246.78.3)、(193.06.3)mg/g，与BMS相比，Glu-BMS的吸附量增加了27%。尽管经过葡萄糖醛酸功能化之后，双介孔硅的比表面积、孔径、孔容积均有所下降，但是每引入一个葡萄糖醛酸基团，增加了4个-OH，增强了吸附剂与胆红素的氢键结合作用，因而对胆红素的吸附量增大，Glu-BMS与胆红素的作用示意图如图4(a)插图所示。

2.2.4 离子强度对胆红素吸附的影响

从图4(b)可知，随着NaCl浓度的上升，BMS和Glu-BMS对胆红素的吸附量都有所下降，但总体上来看下降幅度不大。原因可能在于，随着NaCl浓度增大，胆红素分子中的-COO-周围聚集了较多的正离子，空间位阻效应影响了胆红素与吸附剂之间的结合作用，导致吸附量略有降低。

图4 胆红素初始浓度(a)和离子强度(b)对胆红素吸附的影响Fig 4 Effect of initial concentration and ion strength on bilirubin adsorption

2.2.5 人血清白蛋白(HSA)对胆红素吸附的影响

人体血液中血清蛋白与胆红素分子有着非常重要的联系，游离胆红素(间接胆红素)在未进入肝脏之前是与血清白蛋白形成复合物在血液中进行输运的，进入肝脏后胆红素与蛋白分离后，与葡萄糖醛酸结合形成直接胆红素随胆汁排出。实验研究了HSA浓度对胆红素吸附的影响，由图5(a)可知，当共存HSA的浓度从0 g/L增大至50 g/L时， Glu-BMS对胆红素的吸附量下降了约10%；而BMS对胆红素的吸附量则下降明显，当HSA的浓度为50 g/L时，吸附量下降至原来的25%。HSA能与胆红素形成复合物，HSA-胆红素的结合作用与吸附剂-胆红素的结合作用形成竞争关系，未功能化时，BMS-胆红素的结合作用弱于HSA-胆红素的作用，因而HSA浓度增大时，胆红素吸附量下降显著。葡萄糖醛酸功能化增强了Glu-BMS与胆红素的结合作用，削弱了HSA对胆红素吸附的影响，使Glu-BMS对胆红素的吸附具有良好的选择性。

图5 HSA浓度对胆红素吸附的影响(a)与二级动力学曲线、Langmuir吸附等温线(b)Fig 5 Effect of HSA on bilirubin adsorption and the kinetic and thermodynamic models for bilirubin adsorption

2.3 吸附动力学与热力学研究

分别采用准一级动力学(式2)以及准二级动力学模型(式3)来描述葡萄糖醛酸功能化双介孔硅对胆红素的吸附动力学行为。

lg(Qe-Q)=lgQe-k1t/2.303

(2)

(3)

式中，t为吸附时间(min)，Q为吸附t分钟后的吸附量 (mg/g)，Qe表示平衡吸附量(mg/g)，k1为一级吸附动力学方程的速率常数(1/min)，k2为吸附动力学方程二级速率常数(g/mg·min)。分别以log(Qe-Q)～t、对t/Q～t对实验数据进行拟合，拟合曲线的相关参数如表2所示。很显然，葡萄糖双介孔硅对胆红素的吸附过程与二级动力学模型吻合较好(图5b)，说明在胆红素吸附过程中，化学吸附占主导作用。

吸附剂对物质的吸附热力学常用Langmuir和Freundlich等温吸附模型来进行研究，相关公式分别如式4、5所示。

Ce/Qe=Ce/Qm+1/(KLQm)

(4)

lnQe=(1/n)lnCe+lnKF

(5)

Ce为平衡时溶液中胆红素的浓度(mg/L)，Qe为平衡吸附量，Qm为饱和吸附量，KL、KF为Langmuir常数和Freundlich常数，分别以Ce/Qe～Ce、lgQe～lgCe作图，拟合得到的曲线参数列于表3。从拟合曲线的相关系数R来看，很显然Glu-BMS对胆红素的吸附与Langmuir模型吻合较好(图5(b)插图)，属于单分子层吸附，一旦吸附剂中的结合位点被胆红素分子占据后，就达到饱和吸附。从Langmuir拟合曲线计算得到的理论饱和吸附量为250.0 mg/g，与实际测量得到的吸附量(246.7±8.3)mg/g相一致。目前文献报道的吸附剂对胆红素的最大吸附量大于100 mg/g的例子并不多见，R. Zhao等制备了聚乙烯亚胺接枝的静电纺丝聚丙烯腈纤维膜，对胆红素的吸附量为112.87 mg/g，但是其吸附平衡时间约为2 h[16]。苏沙沙等报道的介孔碳材料吸附速度非常快(2 min), 对胆红素的吸附量达187 mg/g，主要原因在于介孔碳拥有较高的比表面积 (1 438 m2/g)、大的孔容(0.98 cm3/g)和窄的介孔孔径分布(平均孔径为3.1 nm)[8]。实验结果表明，经过葡萄糖醛酸功能化的双介孔硅对胆红素具有优异的吸附性能，能够实现对胆红素的快速、高效吸附。

表2 一级与二级动力学方程相关参数.Table 2 First- and second-order kinetic constants for Glu-BMS

表3 Langmuir and Freundlich等温线相关参数Table 3 Langmuir and Freundlich adsorption isotherm constants

3 结 论

模仿肝脏内胆红素与葡萄糖醛酸结合而被代谢的过程，通过酰胺化反应在双介孔硅中引入葡萄糖醛酸基团得到葡萄糖醛酸功能化的双介孔硅胆红素吸附剂。该吸附剂对游离胆红素具有优异的吸附性能，吸附快速、高效，吸附平衡为15 min，最大吸附量为(246.7±8.3)mg/g，选择性好，血清蛋白的存在基本不影响胆红素的吸附。