血小板微粒促进动脉粥样硬化发生的研究进展

郭方君，杨人强

(南昌大学第二附属医院 心血管内科， 江西 南昌 330000)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心血管疾病中很重要的一种病变，如急性冠脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)是一类突发性疾病，然而究其原因，这类疾病是由AS造成的。AS是一种血管内皮上的斑块结构，由脂质和免疫细胞在血管壁中累积而成，随着病变进展，斑块破裂出血形成血栓，阻塞血管，导致心肌梗死、卒中等急性心血管事件的发生。经皮冠状动脉介入治疗能迅速打开阻塞的血管，然而血管重建后斑块形成、支架再狭窄[1]、抗血小板药物治疗抵抗的患者发生心血管事件的风险增加，因此临床上需要对新的诊断生物标志物进行研究， 寻找有效的治疗措施来减少心血管疾病的发病率。血小板微粒(platelet-derived microparticles，PMPs)在AS内皮细胞损伤、炎性反应、脂蛋白沉积等过程中均有一定的促进作用，其与心血管疾病的发生发展密切相关。因此，本文就PMPs促进AS的发生发展作一综述。

1 血小板微粒概述

微粒是由细胞分泌的大小在0.1～1 μm的囊泡，其表面可携带一定量的磷脂酰丝氨酸、脂质、膜蛋白等物质。微粒可由血液中的多种细胞如血小板、白细胞、红细胞、内皮细胞等释放入血循环，其中PMPs是血液中最丰富的微粒。

1.1 血小板微粒的来源和结构

静息、活化、凋亡的血小板均可以产生PMPs。在体内主要是化学激动剂激活血小板后产生。常见的化学激动剂有胶原、花生四烯酸、二磷酸腺苷、脂多糖、凝血酶等，其中凝血酶是血小板强有效的激动剂，此外，物理激动剂剪切应力也可激活血小板。激动剂激活时间与PMPs释放量成正比，时间越长，量越多。激动剂与血小板膜上的受体结合，引起胞内第二信使发生变化导致血小板激活释放微粒，如脂多糖与血小板表面toll样受体4[2]结合、凝血酶通过凝血酶受体激活肽[3]激活血小板，激活的血小板可通过囊泡相关膜蛋白释放血小板胞浆微粒。

PMPs的大体结构由一层薄膜围成的单囊泡或多个单囊泡包围的大囊泡，血小板质膜和细胞质里的各种成分构成囊泡的内容物。电镜下静息血小板的平均直径在2～4 μm，可以看到α-颗粒、致密颗粒、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体和糖原颗粒、呈空泡状和回旋通道开放的小管系统(open canalicular system，OCS)。激动剂引起血小板质膜形成深的内陷和皱褶，OCS管腔扩大，包含各种包涵体的细胞内空泡，如α颗粒、致密颗粒、膜成分和疏松包裹体，形成阿米巴样血小板，进一步将血小板体分解成碎片，即PMPs。PMPs直径0.05～2 μm不等，绝大多数在0.05～0.5 μm，大小、形状各异。根据电镜结构将PMPs分3型：单囊型、多囊型、含有各种细胞器(线粒体、α-颗粒、糖原颗粒等)的电子致密微粒[4]。基于PMPs的结构组成，含有生物活性物质的PMPs被释放出血循环仍可行使一定的生物学功能。

1.2 血小板微粒的生物学功能

PMPs作为细胞间信息交流的载体，向靶细胞传递生物活性蛋白、mRNAs以及miRNAs，参与止血和血栓形成、炎性反应、免疫、血管生成[5]等病理生理过程。

1.3 血小板微粒的检测

流式细胞测量术是检测血液中微粒的常用技术手段，该方法根据细胞膜表面的特异性抗原可以判断微粒的细胞属性，如CD41和CD62E分别是血小板和内皮细胞表面抗原[6]；根据不同大小的磁珠可以计数微粒的数量。但此方法的一个缺点是无法检测直径小于0.3 μm的微粒，而这些未能检测出的微粒占很大的PMPs比重。所以流式细胞测量术在确定PMPs的标准值范围上面临很大的挑战，近年来，科研工作者开发纳米级流式细胞测量术[7]、纳米粒子跟踪分析[8]、动态光散射[9]等方法致力于建立检测和计数PMPs的统一标准。

2 血小板微粒在动脉粥样硬化中的作用

ACS患者血浆PMPs水平高于稳定性心绞痛患者，稳定性心绞痛患者PMPs水平高于健康人[10]，说明PMPs的血浆水平与AS的发生发展密切相关。

2.1 血小板微粒与内皮细胞损伤

血管内皮细胞在维持心血管稳态方面起重要作用，内皮细胞损伤是AS发生发展过程中的重要早期事件。糖尿病性AS大鼠血浆PMPs水平升高，主动脉摄取血浆中高水平的PMPs，PMPs通过激活雷帕霉素靶蛋白复合物通路破坏主动脉内皮细胞连接蛋白，降低内皮细胞一氧化氮水平至50%，增加两倍的活性氧生成量，从而增加内皮通透性[11]，为脂质及单核细胞进入内皮细胞提供了良好的前提基础。暴露于PM2.5的血小板释放的PMPs与内皮细胞共孵育后，PMPs进入内皮细胞，细胞间黏附分子(ICAM-1)、炎性因子(IL-6、TNF-α)以及内皮细胞的活性氧水平明显升高，PMPs通过线粒体凋亡机制诱导血管内皮细胞损伤[12]。

2.2 血小板微粒与炎性反应

炎性反应是AS的标志，由各种炎性细胞及炎性因子参与其中。PMPs主要通过两种机制参与动脉粥样硬化炎性反应。1)PMPs含有血小板炎性分子P选择素(P-selectin)、趋化因子等，这些具有生物活性的分子牵引白细胞黏附于血管内皮细胞，参与血管的炎性反应。首先PMPs通过整合素黏附于内皮细胞上，然后通过P-selectin/PSGL1捕获白细胞，最后通过CXC趋化因子将白细胞稳定黏附于内皮细胞，增加内皮损伤后的炎性反应[13]。2)PMPs进入血管内皮细胞或平滑肌细胞，诱导细胞分泌炎性因子。PMPs通过内皮细胞表面Gas6进入内皮细胞，诱导内皮细胞表达ICAM-1，促进内皮细胞分泌细胞因子[17]。AS病变内PMPs将平滑肌细胞由梭形转变为菱形，失去收缩表型的特征，PMPs的趋化因子CXCL4诱导平滑肌细胞迁移，PMPs的P选择素、CD40L促进单核细胞黏附于平滑肌细胞，触发平滑肌细胞产生和释放炎性介质IL-6[14]，表明PMPs在AS病变中诱导平滑肌细胞发生炎性表型的改变。

2.3 血小板微粒与脂蛋白的沉积

脂质代谢异常与AS的发生密切相关。低密度脂蛋白经氧化形成氧化低密度脂蛋白后(oxidized low-density lipoprotein; Ox-LDL)，被血管中的巨噬细胞和平滑肌细胞吞噬形成泡沫细胞。首先，血小板可以摄取血液中的脂质。研究发现，冠心病患者的血小板中氧化磷脂、胆固醇酯、鞘磷脂等脂质水平升高。ACS患者血小板通过CXCL12/CXCR7促进其摄取LDL，摄取的LDL促进血小板活性氧及线粒体超氧化物的生成，使LDL氧化成Ox-LDL[15]。随后Ox-LDL随PMPs进入血循环。PMPs中的主要脂质是溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine; LPC)，PMPs是LPC的良好载体，使得LPC不易被血清溶血磷脂酶降解。LPC是Ox-LDL中的生物活性分子之一，因血小板表面表达LPC的受体，故LPC又可诱导血小板活化、聚集、黏附、扩散和迁移以及形成血小板-单核细胞连接。在小鼠AS模型中发现，血浆PMPs中LPC水平增加；并且在小鼠和人类不稳定AS斑块中，LPC含量丰富[16]，说明循环PMPs中的LPC可以沉积在斑块内，作为斑块不稳定的标志。

2.4 血小板微粒与巨噬细胞的吞噬

在内皮功能受损情况下，单核细胞进入血管后转变成巨噬细胞，巨噬细胞吞噬脂蛋白形成了AS中的泡沫细胞。衰老的血小板通过凋亡途径产生的PMPs，对单核细胞具有趋化作用，并与单核细胞结合黏附于内皮细胞。而且，PMPs促进单核细胞分化，而抑制其增殖，使单核细胞极化成M2亚型，增强单核细胞对Ox-LDL的吞噬作用[17]。凝血酶激活的血小板产生的PMPs被巨噬细胞吞噬，PMPs又增强巨噬细胞吞噬Ox-LDL；此外，PMPs增加巨噬细胞分泌炎性因子IL-1β，IL-6，TNF-α，这些都与AS的炎性反应相关[18]。PMPs中的miRNA也可调控巨噬细胞的吞噬作用。荧光标记的PMPs与巨噬细胞共孵育后，共聚焦显微镜观察到巨噬细胞能够摄取70%～90%的PMPs；且qPCR检测巨噬细胞中miR-126-3p升高约4.5倍，miR-126-3P在mRNA和蛋白质水平上调控巨噬细胞的吞噬功能；在AS斑块内，用荧光标记的乳胶微珠评估其吞噬能力，共聚焦显微镜发现巨噬细胞吞噬乳胶微珠的数量明显增加，这些发现表明PMPs可以递送miRNA至巨噬细胞，并重新编程使其具有吞噬功能[19]。

2.5 血小板微粒与斑块的不稳定

ACS患者中，其血浆肌钙蛋白水平以及C反应蛋白水平高于稳定心绞痛患者，同时血浆PMPs水平也相应升高，说明PMPs血浆水平也可作为斑块不稳定的血液学标志[10]。载脂蛋白E敲除小鼠高脂喂养造成AS模型，注射不同剂量的PMPs后，高剂量PMPs使AS小鼠血浆炎性因子(CRP、 IL-1β 和 TNF-α)水平升高，主动脉的粥样斑块区域增大，斑块脂质核心、巨噬细胞数量明显增加，斑块内胶原蛋白含量和平滑肌细胞数量降低，说明PMPs促进AS小鼠主动脉斑块的形成，促进斑块内巨噬细胞的浸润和炎性反应，降低胶原蛋白的含量和平滑肌细胞的数量，从而降低斑块的稳定性[20]。

3 药物对血小板微粒的影响

抗血小板药物不仅可以抗血栓，还可降低血浆PMPs水平。体外分离的血小板实验，阿司匹林能抑制PMPs含量6.3倍[21]。在糖尿病大鼠模型中，阿司匹林可以抑制血循环中PMPs水平，减少内皮细胞活性氧的生成，从而缓解血管内皮损伤，预防糖尿病早期AS的进展[11]。阿司匹林联合氯吡格雷或替格瑞洛比单纯运用阿司匹林可以进一步减少心肌梗死大鼠PMPs的血浆水平及大鼠心肌梗死面积[22]。但急性心肌梗死伴慢性肾脏病的患者，尽管进行了双重抗血小板治疗，其血浆PMPs水平较心肌梗死肾功能正常者仍然更高[6]。

4 问题与展望

综上，PMPs促进AS发生发展。但由于PMPs直径极小、结构组成复杂、表面标志物多，现在常用的检测工具还无法确定其在临床的参考值范围。目前血小板释放PMPs的具体机制也尚不清楚，基础实验表明抗血小板药物可以抑制释放PMPs，但临床上出现一部分患者对抗血小板药物抵抗或治疗后出血风险增加的情况。尽管还存在上述问题，但越来越多的研究表明PMPs有望成为疾病的生物标志物，PMPs不仅对卒中患者下一次心血管事件的发生有预测价值[23]，还可作为判断类风湿关节炎[24]、抗中性粒细胞胞质抗体相关血管炎[25]活动性的潜在生物标志物。继续深入挖掘PMPs的结构与生物活性物质，及潜在的生物学功能，提高检测工具的特异度与灵敏度，PMPs有望成为心血管疾病的标志物和治疗靶点。