乙烯利对青春期前SD雌性大鼠性早熟的影响及其机制研究

徐 莹，苟 练，敬明武，葛宇龙，刘科亮，，徐培渝，

(1．四川大学华西公共卫生学院/华西第四医院，四川 成都 610041；2．四川省疾病预防控制中心，四川 成都 610041)

乙烯利(ethephon，ETH)是植物生长调节剂中常用的一种，主要用于催熟果实。根据毒理学研究结果，小于2 mg/kg的乙烯利不会对机体造成损害。但近年来，由于其低剂量高效益的特点，导致其被普遍滥用。据文献报道，高剂量乙烯利使雄性小鼠的精子活动率和精子计数明显受到影响，使雌鼠子宫、卵巢质量增加，子宫/体质量比明显高于对照组(蒸馏水)[1-2]。更有文章质疑儿童出现性早熟的原因是摄入了过量施用了具有激素作用农药的果蔬[3-4]。性早熟指提前出现第二性征发育，导致儿童身材矮小，产生各种生理和心理问题。性发育由HPGA轴调控，青春期启动时，Kisspeptin(KISS-1)或其受体(GPR54/KISS-1R)基因激活启动HPGA轴，下丘脑大量释放GnRH，GnRH与其垂体上受体GnRHR结合后，刺激垂体分泌黄体生成素(lutenizing hormone，LH)和促卵泡生成素(folliclestimulating hormone，FSH)，作用于各生殖器官使其增重发育，使相应器官分泌雌雄激素，从而影响青春期性发育。至今，关于乙烯利促进儿童性早熟的研究尚少，其是否通过影响HPGA轴发挥作用也待进一步研究证实。因此，本研究以青春期前SD雌鼠为模型探讨乙烯利对性早熟的影响以及相关的分子机制，以期为全面评价乙烯利的安全性提供预防措施。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 受试物乙烯利原药50 g，瓶装，纯度≥90%，CAS号16672-87-0。由索莱宝公司生产，购于四川省豪乙生化公司，其性状为灰白色蜡状固体。用蒸馏水配制溶液，冷藏储存。

1.1.2 试剂异丙醇，购自四川豪乙生物有限公司；大鼠黄体生成素酶联免疫吸附检测试剂盒(Rat lutenizing hormone ELISA Kit， 批 号 CSB-E12654r)、大鼠促卵泡生成素酶联免疫吸附检测试剂盒(Rat follicle-stimulating hormone ELISA Kit，批号 CSBE06869r)购于索莱宝生物有限公司。所有引物均由睿博兴科生物技术有限公司合成，引物序列如表1。

1.2 方法

1.2.1 实验动物与分组处理第一批SPF级SD雌性孕鼠自行产子，由亲鼠自养，仔鼠出生15日龄(postnatal day 15，PND 15)时，根据动物的体质量，按窝别随机分为4组，乙烯利低、中、高剂量组(134、269、538 mg/kg)和阴性对照组(给予同体积蒸馏水)。阴性对照组10只，低剂量组11只，中高剂量组每组各12只。自PND 15时开始经口灌胃染毒每天1次、连续5 d，至PND 21时，断乳。染毒期间每日检查阴道是否开口，上、下午各一次，记录阴道开口时间。幼鼠在末次染毒48 h后，麻醉处置；第二批SPF级SD雌性孕鼠自行产子，PND 15时按上述方法分组，每组仔鼠为9只，开始经口灌胃染毒每天1次、连续5 d，至PND 21时，断乳。处死小鼠，腹主动脉采血2 mL，2 h后分离出血清保存于-80℃冰箱以检测血清中FSH和LH水平；取下丘脑和垂体组织存于-80℃冰箱。

表1 实时荧光定量PCR引物序列

1.2.2 酶联免疫吸附法测定血清中LH、FSH激素水平获得的血清参照LH和FSH ELISA试剂盒说明书进行二者表达水平的测定，采用酶标仪于450 nm波长处，读取吸光度D(450)值。根据D(450)值绘制标准曲线，计算样本浓度。

1.2.3 实时荧光定量PCR检测GPR54、KISS-1、GnRH、GnRHRmRNA表达水平用PureLink RNA Mini Kit试剂盒要求提取垂体和下丘脑中总RNA，UV紫外分光光度计于260 nm波长处检测RNA吸光度，得其浓度；利用罗氏第一链cDNA合成试剂盒，每组取1μg总RNA进行cDNA逆转。然后利用2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR GreenⅠ)进行cDNA扩增。PCR反应条件：95℃、1 min；95℃、10 s，60℃、10～15 s，共40个循环。以β-actin作为内参，采用 2-ΔΔCT值(ΔCT=CT，目的基因-CT，β-actin；ΔΔCT=ΔCT，实验组-ΔCT，对照组)表示目的基因mRNA相对表达水平。

1.3 统计学分析

实验数据均通过SPSS 17.0进行统计分析。数据先进行方差齐性检验，若方差齐，进行方差分析，如P＜0.05，用LSD法进行两两比较；若方差不齐，转换数据后，再进行方差齐性检验；若仍不齐，用秩和检验，如P＜0.05，用Dunnett’s T3法进行两两比较。应用Graphpad Prism 5.0软件作图。

2 结果

2.1 乙烯利对青春期前SD雌性大鼠急性经口毒性研究

在进行乙烯利对SD雌性大鼠性发育影响的探究之前，本实验进行了乙烯利对青春期前SD雌性大鼠的经口急性毒性试验。根据实验结果查表得知，LD50值为4 300 mg/kg，95%置信区间为2 950～6 260 mg/kg。根据急性(LD50)剂量分级评价标准，属于低毒级。后续实验的受试物剂量设置即根据LD50的值。

2.2 乙烯利对青春期前SD雌鼠阴道开口时间的影响

如图1结果所示，乙烯利中剂量组青春期前SD雌鼠阴道开口时间早于阴性对照组，乙烯利高剂量组阴道开口起始时间明显晚于对照组，且差异均有统计学意义(P＜0.01)。

图1 乙烯利各处理组中大鼠阴道开口时间

2.3 乙烯利对SD雌鼠血清性激素水平变化的影响

如表2所示，乙烯利高剂量组的FSH浓度与阴性对照组相比降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，乙烯利中、低剂量组的FSH浓度与阴性对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；乙烯利低、中、高剂量组的LH浓度与阴性对照比较差异亦无统计学意义(P＞0.05)。

表2 乙烯利各处理中青春期前SD雌鼠血清激素水平(x±s)

2.4 乙烯利对HPGA轴相关基因的影响

下丘脑组织HPGA轴相关基因mRNA的表达情况如图2所示，对GPR54、KISS-1、GnRH基因，在乙烯利中剂量组的mRNA表达水平均高于对照组，且差异有统计学的意义(P＜0.05)，乙烯利低、高剂量组的表达水平与对照相比，差异无统计学意义。垂体组织中，乙烯利各剂量组组中GnRHR mRNA表达水平与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。

图2 乙烯利各处理中青春期前SD雌鼠下丘脑和垂体组织中HPGA轴相关基因的mRNA表达水平

3 讨论

生殖发育毒性指受试物对人体生殖器官、内分泌系统产生了有害影响以及不良妊娠结局的出现。阴道开口与第一次排卵的时间，是判断雌鼠青春期起始两个决定性指标[5]。本实验中，乙烯利中剂量组促进青春期前SD雌性大鼠阴道开口时间提前，高剂量组使其延后，且差异均较对照组具有统计学意义，本实验结果再一次明确了一定剂量的乙烯利能导致青春期前SD雌性大鼠性早熟。PND 29时，阴性对照组大鼠阴道陆续开口，PND 25/26时，低、中剂量组大鼠阴道陆续开口，而高剂量组第1只大鼠阴道开始时间是PND 32，比阴性对照组晚了3天。本实验剂量设计参考急性毒性试验结果，高剂量组出现阴道开口时间推迟，可能与高剂量组大鼠体质量降低(结果未展示)等毒性反应有关，同时激素具有正向促进和反向抑制的双向调节作用，因此，在高剂量下阴道开口时间较阴性对照组推迟的另一原因可能是在高剂量下，激素水平已高达一定程度进而对青春期性发育调控起抑制作用。

促性腺激素广泛存在于血清中，主要作用是促进子宫、卵巢和睾丸等生殖器官的生长和发育，并刺激生殖器官分泌雌激素和雄激素，进一步促进子宫、输卵管、阴道及外生殖器的生长发育。因此血清中性激素(LH和FSH)浓度也常被作为评价性发育的指标。本实验中，各处理组血清中LH、FSH浓度与对照组相比并无明显差异。研究发现，大鼠脑组织中，弓状核及脑室前腹侧区的KISS-1基因编码Kisspeptin。GPR54是Kisspeptins的特异性受体，大量存在于下丘脑，Kisspeptins与GPR54结合，激活GnRH神经元，并大量分泌GnRH[6-8]。后者被认为是青春期启动的分子阀门[9]。下丘脑释放的GnRH与其在垂体的受体(GnRHR)结合后，促进垂体合成分泌促性腺激素(LH和FSH)。基于此，我们在转录水平进一步探究了乙烯利对KISS-1/GPR54/GnRH/GnRHR表达的影响。在本实验结果中，乙烯利中剂量组中KISS-1/GPR54/GnRH mRNA表达水平均高于对照组，且差异具有统计学意义(P＜0.05)，因此可以提示FSH和LH在实验观察期间可能发生了变化。然而，本实验中并未观察到FSH和LH改变可能是由于血清性激素水平呈动态变化，而在本实验时间点条件下，未见乙烯利对青春期前SD雌鼠血清激素水平产生明显影响。因此，根据本实验结果暂不能认为乙烯利对血清中性激素水平产生了影响。

综上，我们的实验结果明确了一定剂量的乙烯利会促进青春期前SD雌性大鼠性早熟。其作用的机制可能与上调KISS-1/GPR54/GnRH/GnRHR信号通路的表达有关。由于本实验取材时间点设计不够完整，因此未能观察到激素水平的变化。建议后续实验增加各组处理动物的数量，以增加采血的时间点，多时间点测血清激素，以使实验数据更完善。