白细胞介素-35(IL-35)在人慢性根尖肉芽肿中的表达情况及临床意义

陈 直，宋 伟, 朱永娜，刘 茜

(1.蚌埠医学院，安徽 蚌埠 233000；2.蚌埠医学院第二附属医院，安徽 蚌埠 233000)

慢性根尖肉芽肿是一种最常见的慢性根尖疾病。该疾病以炎性骨组织破坏吸收为特征[1]。促炎因子和抗炎因子(如细胞白介素-17，白细胞介素-27及白细胞介素-12等)在慢性根尖肉芽肿的发生、发展中发挥重要的调节作用[2]。

白细胞介素-35(IL-35)是一种新发现的、主要由调节性T细胞(Tegulatory T cells, Tregs)分泌的免疫调节因子，该因子隶属于白细胞介素-12(Interleukin-12，IL-12)家属[3]。文献报道Tregs可以抑制慢性根尖周炎中白细胞介素-17(Interleukin-17, IL-17)的分泌，抑制根尖组织炎性反应及组织破坏[4]。IL-12家族成员还包括白细胞介素-27(Interleukin-27，IL-27)、白细胞介素-12(Interleukin-12, IL-12)及白细胞介素-23(Interleukin-23, IL-23)三种炎性因子。研究发现IL-12家族中的IL-27、IL-12及IL-23调节慢性根尖周病发生进展，其中IL-12及IL-27发挥双重作用[2]。

Tregs及IL-12家族炎性因子调节慢性根尖周炎的发生发展，扮演重要角色。但是，IL-35作为由Tregs分泌的IL-12家族的新成员，其慢性根尖周炎中的作用尚不清楚。因此，本课题探讨IL-35在慢性根尖肉芽肿中的表达，分析其临床意义，为促进该疾病的治疗提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2018年3月～2018年5月就诊于蚌埠医学院第二附属医院、临床及影像学诊断为慢性根尖肉芽肿的患者。入选标准：①年龄在18～65岁；②无其他口腔疾病和全身系统性疾病；③3个月内未服用抗生素和其他激素类药物；④X线诊断为慢性根尖肉芽肿；⑤有拔牙指征，且无拔牙禁忌证， 筛选患者并收集拔除患牙的根尖软组织。另选取同期在本院因拔除阻生牙时切除的健康软组织5例为对照组，患者符合纳入标准的①②③⑤。所有操作均取得患者知情同意，并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1HE染色:将收集到的软组织用等离子水冲洗3 min，去除多余水分后，用4%福尔马林固定24 h，然后石蜡包埋。将蜡块切成4 μm厚的连续切片，按HE染色步骤进行染色。封片后，倒置显微镜下观察染色结果，根据判断标准判定标本类型。根尖肉芽肿病理判断标准为可见以大量炎性细胞、毛细血管和成纤维细胞增生为主的炎性肉芽组织。筛选出影像学和病理诊断一致并符合要求的标本，最终获得试验组8例。

1.2.2免疫组织化学:根据SP步骤，将符合试验标准的石蜡包块切成4 μm厚的连续切片。常规二甲苯脱蜡乙醇梯度脱水，等离子水漂洗。取出切片置于3%的过氧化氢溶液中充分灭活内源性酶，蒸馏水冲洗3次，3 min/次。然后将切片浸在0.01 M柠檬酸钠缓冲液中加热用于热修复抗原，冷却至室温后用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)充分洗涤。滴加封闭液，室温20 min后去除多余液体，滴加一抗50 μl避光放于4℃恒温箱12 h(一抗1∶400稀释)。恢复至室温后滴加羊抗兔二抗50 μl在37℃恒温箱孵育30 min，用PBS充分洗涤。然后滴加链霉亲和素-POD工作液，于37℃恒温箱中孵育30 min，PBS充分洗涤，将滴加DAB显色液滴，镜下控制染色时间，待充分染色后，蒸馏水洗去多余液体；苏木素轻度复染，脱水，中性胶封片，显微镜下观察并拍照。用PBS缓冲液代替一抗孵育切片作为阴性对照组。

阳性试验结果判断的标准为细胞核、细胞质或细胞膜上出现黄色或棕色颗粒。每张切片随机选取5个视野进行拍照，并用Image-J软件进行分析。

1.3统计学分析：数据分析采用SPSS20.0统计软件，计量资料以均数±标准差表示。采用独立样本t检验分析比较两组中IL-35的表达情况。所有检验均以α=0.05作为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组HE结果比较：试验组见大量炎性细胞浸润，大量成纤维细胞增生(见图1A)。对照组见大量纤维组织及少量炎性细胞(见图1B)。

图1 两组患者病理切片图

2.2IL-35的表达情况:试验组和对照组均可见IL-35表达(如图2)。试验组IL-35表达量为0.422±0.044，对照组则为0.086±0.011，经t检验，试验组IL-35表达高于对照组，两组间差异有统计学意义(t=16.37，P<0.05)。

图2 IL-35在实验组和对照组均表达

3 讨论

慢性根尖肉芽肿是引起颌骨破坏的一种常见炎性疾病，根管系统内的细菌感染引起宿主一系列的免疫炎性反应，这一反应过程中的炎性细胞、促炎因子(如中性粒细胞、IL-17、白细胞介素-1)等导致根尖软硬组织的破坏[5]。此外，在根尖肉芽肿的发生过程中机体启动保护机制，如调节性T细胞增加，抗炎因子的分泌增多等[6-7]。IL-35是IL-12家族的最新成员，在炎性疾病中发挥抗炎作用。但是，IL-35是否在慢性根尖肉芽肿中表达尚不清楚。因此，本课题探索IL-35在慢性根尖肉芽肿中的表达情况，以期促进该疾病的治疗。

本课题发现在慢性根尖肉芽肿中IL-35的表达量为0.422±0.044，正常对照组中的表达量为0.086±0.011，前者表达较高。Aksha等人用RT-PCR比较了IL-35在慢性牙周炎及侵袭性牙周炎中的表达情况，研究发现，慢性牙周炎患者的牙龈组织中该因子的表达量高于侵袭性牙周炎患者的牙龈组织，正常牙龈组织中IL-35的表达量最低[8]。刘迪昕等人用ELISA研究发现牙周炎患者血清和龈沟液中IL-35的表达较健康者血清和龈沟液中的表达高[9]。本研究中IL-35在慢性根尖肉芽肿的表达较高，与之前牙周炎中IL-35表达较高结果一致，可能因为慢性根尖肉芽肿和牙周炎相同均伴随炎性骨吸收。

IL-35主要由诱导型调节性T细胞分泌。Tregs能够抑制炎性反应，抑制疾病的进展。体外研究发现Tregs在骨组织代谢中，抑制破骨细胞的形成，抑制骨组织的吸收破坏。体内研究发现，Tregs能够抑制类风湿性关节中骨组织破坏[10]。Carolina等人发现在牙周炎进展过程中，向病损组织迁移的Tregs增多，同时随着该细胞的增多，牙周骨组织破坏减缓，表明该细胞能够减轻牙周炎炎性反应及骨组织吸收[11]。2016年学者通过鼠实验性根尖周炎模型，探索Tregs在慢性根尖周炎中的作用，结果发现随着病情的发展，Tregs 量逐渐增加，而抑制 Tregs后，与对照组相比，其在疾病诱导的第14天和第21天根尖病损直径较大。在野生型鼠根尖周炎中Tregs数量和根尖病损程度成反相关。研究还发现在抑制鼠Tregs后，除了根尖周病损增大外，同时促炎因子(如IL-17、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1)分泌增高，Treg 标志分子(如IL-10)及组织愈合分子的降低，可见Tregs 细胞在根尖炎进展过程中发挥抑制疾病进展，促进组织愈合的作用[4]。本研究发现根尖肉芽肿中IL-35的表达较正常对照组高，可能与分泌IL-35的 Tregs在慢性根尖周炎增多相关。 IL-35与Tregs在慢性根尖肉芽肿的关系还需要进一步的研究。

IL-35在炎性反应过程中发挥抗炎作用，而IL-17是由Th17细胞分泌的一种重要的促炎因子，因此学者探索了IL-35与IL-17的关系。KochetkovaI等人在2010年发现IL-35通过刺激IL-10依赖的CD4阳性T细胞间接抑制IL-17的分泌[12]。后来Okada等人在2017年发现IL-35能够通过抑制Th17的转录因子，直接抑制该因子的分化，抑制IL-17的分泌[13]。在炎性反应疾病中，IL-35通过抑制Th17细胞的应答，抑制IL-17的释放发挥其抗炎作用。之前的研究发现在鼠实验性根尖周炎及人根尖周炎中均发现IL-17的表达，IL-17在根尖周炎的急性期表达升高，IL-17在慢性根尖炎的发生进展中扮演重要角色[14]。在慢性根尖肉芽肿中，IL-35可能通过抑制IL-17，发挥其抑制作用，但还要进一步研究。

综上所述，慢性根尖肉芽肿中IL-35的表达较高，IL-35可能在该疾病中发挥抑制根尖区组织炎性反应，抑制组织破坏的作用。但本实验有实验方法单一，样本量的不足。