新型冠状病毒RNA复制酶及其潜在抑制剂研究现状

李港 谢建平

截至 2020年5月12日，严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)导致的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)全球大流行(pandemic)已确诊4 284 424 例，累计死亡283 493例。这种新型冠状病毒最初于2020年1月12日被世界卫生组织命名为 “2019新型冠状病毒” (novel coronavirus 2019，2019-nCoV)。随后在2020年2月11日，国际病毒分类委员会冠状病毒研究小组根据系统学、分类学及惯例将其正式命名为“严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2”(SARS-CoV-2)[1-2]。

由于缺乏特效药和疫苗，对症治疗有效率较低，治疗周期长久，费用高昂，不良反应比较严重[3-6]。冠状病毒的高度变异性使得治疗和预防都面临极大困难[7]。深入研究病毒生物学性质，加速抗 SARS-CoV-2 的药物和疫苗研制非常必要。近年来，特定靶向抗病毒治疗(specifically targeted antiviral therapy for HCV，STAT-C)是抗病毒研究的一个重要方向[8]。与哺乳动物细胞或者其他病毒 DNA 序列的复制比较，RNA 病毒基因组复制未经校读(proofread)或者编辑(edit)，因此忠实性低。这是 RNA 病毒进化快、适应力强，容易流行的一个主要因素。RNA复制酶是冠状病毒复制所需，也是其突变率高的分子基础。笔者对 SARS-CoV-2 的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)结构和功能进行概述，并总结了针对其他冠状病毒的 RdRp 抑制剂。这可能为靶向 SARS-CoV-2 RdRp 的药物研发提供基础。

一、冠状病毒生物学性质

冠状病毒是有囊膜的正链 RNA 病毒，属于巢病毒目(nidovirales)、冠状病毒科(coronaviridae)、冠状病毒亚科，分为 4 个属(α、β、γ 和δ)，其中对人致病的主要是 α-和 β-属病毒[9]。目前已知26种冠状病毒感染威胁动物[10]。7种冠状病毒可感染人类：其中，人冠状病毒-229E (human coronavirus 229E，HCoV-229E)、人冠状病毒-NL63(human coronavirus NL63, HCoV-NL63)、人冠状病毒-OC43 (human coronavirus，HCoV-OC43)、人冠状病毒-HKU1 (human coronavirus，HCoV-HKU1) 4种冠状病毒是人类常见病原体。2019 年 12 月出现的 SARS-CoV-2 是 β-属冠状病毒，与2003 年出现的 SARS-CoV、2012 年出现的中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)关系密切，都能引起致命的呼吸系统疾病[11]。冠状病毒已成为全球公共卫生的严重威胁之一[12]。

冠状病毒主要结构包括：由囊膜包裹的病毒的核心，刺突糖蛋白 S、包膜蛋白 M 和小包膜蛋白 E 则定位在病毒囊膜表面，核衣壳蛋白 N 与病毒单链正义 RNA 基因组结合形成螺旋核衣壳，包裹在病毒囊膜内侧。冠状病毒的基因组约 26～32 kb，是目前病毒中最大的单股正链 RNA 基因组，含有 7～16 个功能不同的可读框(open reading frame，ORF)[13]。基因组 RNA 5′端具有甲基化帽，3′端具有 poly-A 尾。冠状病毒基因组是多顺反子，5′端近2/3被2个大的重叠的开放阅读框架 (ORF 1a和1b)占据，翻译生成复制酶多聚蛋白 pp1a 和 pp1ab[14]。这2个多聚蛋白被2个或3个 ORF1a 编码的蛋白酶切割，释放出 16 个非结构蛋白(nonstructural protein, nsp1～nsp16)[15]。这些非结构蛋白包括蛋白酶、RdRp、RNA 解旋酶、RNA 甲基化加帽酶、核酸外切酶和核酸内切酶等。基因组 3′端1/3的序列则按照固定的顺序编码病毒结构蛋白：(HE)-S-E-M-N，以及各冠状病毒特有的附属蛋白。参与病毒复制的相关蛋白和病毒基因组形成复制/转录复合体(replication and transcription complex，RTC)，病毒基因组 RNA (genomic RNA, gRNA)，负链亚基因组 RNA (sub-genomic RNA)和亚基因组 mRNA(sub-genomic mRNA)均由此复合体进行复制/合成[16]。

冠状病毒基因重组率和突变率高，适应性强，致病性强。作为单股正链 RNA 病毒，冠状病毒能直接以基因组 RNA 作为模板翻译产生蛋白[17]。当两种冠状病毒感染同一宿主时，双方的基因组会发生成百上千碱基对的基因组片段交换，可能产生病毒变异[18]。这可能是近20年内出现 SARS-CoV，MERS-CoV 和 SARS-CoV-2 三种冠状病毒并大规模感染人类的一个主要因素。

二、冠状病毒 RdRp 的结构和功能

SARS-CoV-2 的 nsp12 是典型的 RdRp，也是催化病毒复制和转录的一个关键成分[19]。其结构主要由4个结构域组成：(1)V31-K50 残基组成的一个 N 端 β-发夹结构域[20]；(2)D60-R249 残基组成的类似于尼多病毒 RdRp 相关核苷酸转移酶(Nidovirus RdRp-associated nucleotidyltransferase，NiRAN)结构的 N 端延伸结构域[21]；(3)A250-F369 残基组成的接口域(interface domain)；(4)S367-F920 残基组成的“右手”聚合酶结构域，其中又包括手指(fingers)、手掌(palm)、拇指(thumb)3个亚结构域。Nsp12 的 N 端 β-发夹结构直接插入 RdRp 结构域中的 NiRAN 结构域和手掌亚结构域夹持的凹槽中[20]。SARS-CoV-2 RdRp 结构域的主要活性位点都处在手掌区中，由聚合酶基序(motif)A-G 形成，这些催化残基在 RNA 病毒 RdRp 中普遍保守：其中基序 A 包含残基 T611-M626;基序 B 包含残基T680-T710; 基序 C 由残基 F753-N767 构成，包含一个保守性催化残基(759-SDD-761); 基序 D 包含残基 L775-E796; 基序 E 包含残基 H810-V820; 基序 F 包含残基 K912-E921; 基序 G 包含残基 K500-S518[20, 22]。

在这个结构中，4个带正电荷的三磷酸核苷(NTP)可抵达的路径汇聚到一个中心空腔中，在那里 RdRp 基序介导模板指导的 RNA 合成。NTP 进入通道是由一组亲水残基组成的，包括基序 F 中的K545、R553 和 R555 等3个残基。RNA 模板通过由基序 F 和 G 夹住的凹槽进入由基序 A 和 C 组成的活性位点。拇指亚结构域支撑引物链避免从模板链上脱落。产物-模板杂交物通过聚合酶前侧的 RNA 出口隧道离开活性位点[20]。冠状病毒携带的核糖核酸基因组(约30 kb)比大多数动物核糖核酸病毒(约3～15 kb)至少大2倍。此外，与以 DNA 为基础的生物相比，RNA 病毒通常被认为其遗传物质复制的准确性较低，因为它们缺乏校对和纠正机制[23]。为了确保长度约 30 kb 的 RNA 链被正常合成，冠状病毒已经进化出一种特殊的 RNA 合成机制，它能够在缺少外源 RNA 引物的情况下启动 RNA 从头合成(de novo)，这在所有 RNA 病毒中是独一无二的。此 RNA 合成过程受到严格调控，以最大限度地减少被宿主细胞防御攻击。其中 nsp7 和nsp8 作为 nsp12 的辅助因子激活并促进病毒 RNA 的合成，并与双功能核糖核酸外切酶/RNA帽(鸟嘌呤N-7)甲基转移酶[ RNA cap (guanine N-7) methyltransferase ] nsp14 结合形成 nsp12/nsp7/nsp8/nsp14 复合体。这个复合体将 RNA 聚合、校对和帽子修饰活动整合到一个多功能聚合蛋白中。这个大分子聚合物可能与解旋酶/RNA 三磷酸酶(helicase/RNA triphosphatase)nsp13 和 2′O-MTase[2′O-methyltransferase(甲基转移酶)] nsp16 结合，构成冠状病毒复制/转录机制的核心，它能够参与协调的 RNA 合成和处理活动[15, 24-26]。通过多个 nsp 蛋白的联合作用，保证了冠状病毒近 30 kb 的全长基因组在宿主细胞内有效复制。

三、靶向 RdRp 的药物

冠状病毒的复制周期由侵入、复制、组装与分泌四个阶段构成[27]。首先冠状病毒通过内吞体途径或细胞表面非内吞体途径进入宿主细胞。在此之前，病毒的 S 刺突蛋白诱导病毒和细胞膜的融合[28]。然后，病毒在宿主细胞质中利用宿主细胞器及原料，以病毒的正义单链 RNA 作为 mRNA 翻译生成 RdRp。病毒 RdRp 起始转录完整负义链，生成 mRNA，其亚基因组是嵌套转录模式，具有相同的 5′端不译区和 3′端的 poly-A 尾。病毒 RdRp 与转录调节序列(transcriptional regulatory sequences, TRS)作用，使得 5′前导序列与每个基因的起始序列连接，完成亚基因组 mRNA 合成，然后翻译形成其他结构蛋白。最后，核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，N)和基因组 RNA 组装形成螺旋形核衣壳，并与其他的结构蛋白共同装配成病毒颗粒，经胞吐分泌到细胞外。理论上，阻断病毒复制周期的任何一个环节都可以抑制病毒复制[29]。

高特异性抗病毒靶向药物的发现与研制尤为重要。因为 RdRp 在病毒中高保守，其抑制剂可作为抗 RNA 病毒的广谱抗病毒药物。在 RdRp 蛋白结构中有一个巨大的凹槽结构区作为合成病毒 RNA 的活性中心[16]。SARS-CoV-2 与 SARS-CoV 的 RdRp 蛋白序列相似性高达 96%，而且已有突变位点都不在活性中心。因此，针对 SARS-CoV 病毒 RdRp 的抑制剂有可能治疗SARS-CoV-2感染[17]。

首先是现有药品中的法匹拉韦(favipiravir)。法匹拉韦是一种吡嗪类似物，属于 RdRp 抑制剂，由于其对不同 RNA 病毒的抗病毒活性和高耐药性屏障，具有广谱抗病毒活性[30]。法匹拉韦起初用于治疗新型和复发型流感。法匹拉韦对狂犬病毒、埃博拉病毒等多种RNA病毒均具有较好的抑制作用。法匹拉韦主要是作为前体药物(prodrug)，在真核生物磷酸核糖转移酶的作用下转化为呋喃糖基5′-三磷酸代谢产物(ribofuranosyl 5′-triphosphate, RTP)[31]。Favipiravir-RTP可作为NTP替代物参与病毒RNA链的合成，并抑制甲型流感病毒RdRp的活性。其广谱抗RNA病毒活性可能是Favipiravir-RTP掺入正在延伸的病毒RNA链中，通过模糊的碱基配对或链终止导致致死性突变，或者与三磷酸腺苷(ATP)和鸟苷三磷酸(GTP)竞争性结合保守的聚合酶结构域而阻止病毒RNA的复制[30]。

利巴韦林(ribavirin)是一种具有广谱抗病毒活性的尿苷类似物(1-β-D-呋喃呋喃糖基-1,2,4-三唑基-3-羧酰胺, 1-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide)，临床上多用于拉沙热、严重呼吸道合胞病毒感染和丙型肝炎病毒(HCV)感染的治疗。利巴韦林属于尿苷类似物，可竞争性抑制病毒的三磷酸尿苷合成，使RNA复制因缺少原料而中断，从而抑制病毒在宿主体内的扩散。利巴韦林也能被整合到病毒基因组中，导致错配，增加不能存活的病毒颗粒的产生，并能抑制细胞内的肌苷单磷酸脱氢酶 (inosine monophosphate dehydrogenase，IMPDH)活性来耗尽细胞内的GTP，从而达到抗病毒作用[32]。

瑞德西韦(remdesivir, GS-5734)是核苷类抗病毒药品，是一种新型的L-丙氨酸2-乙基丁酯氨基磷酸酯(2-ethylbutyl L-alaninate phosphoramidate)前体药品，体外可有效抑制冠状病毒，其在细胞内三磷酸化后会与ATP竞争抑制 RdRp 的活性。在多种细胞内可转变成NTP活性形式，它结合到新生病毒 RNA 链中，导致复制链早熟终止，最终抑制病毒核酸的合成。瑞德西韦最初用于埃博拉(Ebola)病毒感染，在培养细胞、小鼠和非人灵长类动物(nonhuman primate，NHP)模型中对 MERS-CoV、SARS-CoV 以及尼帕病毒(Nipah virus)等多种 RNA 病毒均具有抑制活性, 是一种很有前景的抗病毒药品[17, 33]。

有些抗病毒药品虽然不是靶向 RdRp，但可以间接干扰 RdRp 的功能，从而阻止病毒复制，如洛匹那韦/利托那韦(lopinavir/ritonavir)、干扰素等。美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA) 2000 年批准洛匹那韦/利托那韦用于治疗艾滋病。洛匹那韦/利托那韦的主要有效成分洛匹那韦可抑制病毒的蛋白酶，使病毒复制后期的多聚蛋白不能顺利裂解，产生未成熟、感染能力减弱的病毒。冠状病毒的复制也需要病毒蛋白酶的作用，洛匹那韦/利托那韦可能会与冠状病毒蛋白酶结合从而抑制其正常功能[3-5]。中华人民共和国国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》试行第五版中说明洛匹那韦/利托那韦可试用于临床新型冠状病毒的抗病毒治疗[6]。

干扰素可以促进人体抗病毒蛋白的生成，具有抗病毒和免疫调节作用。体外，干扰素可抑制冠状病毒的复制，其中β干扰素的抑制能力最强。临床上，干扰素与利巴韦林联合使用可显著抑制冠状病毒的复制[34]。

四、结论

COVID-19疫情出现以后，已有多个药物进入治疗 COVID-19 的临床研究。病毒 RdRp 相对其他病毒蛋白保守性较高，与 SARS-CoV RdRp 的氨基酸序列相似性高达 96%，提示可能是一个重要候选靶标。SARS-CoV-2 的 RdRp 结构功能及其抑制剂的深入分析有助于研发新药物。