苏苏小儿止咳颗粒提取工艺研究中鞘蕊苏的质量控制

张 慧，何建华，顾成刚，朱丽玲，吴 宁△

（1．武汉军谷坊科技开发有限公司，湖北 武汉 430075； 2．武汉药谷科技开发有限公司，湖北 武汉 430075）

小儿咳嗽为儿科临床常见病，易反复发作，目前用于小儿咳嗽的中成药中，以治疗热咳的药物居多，专用于小儿寒咳的极少，且疗效较快的药物大多含有麻黄碱、可待因等药物，不适于小儿服用。针对这一现状，本课题组研制了苏苏小儿止咳颗粒。其属中药新药注册6．1类，已获国家药物临床试验批件和发明专利证书，处方来源于医院临床应用多年的经验方，对治疗外感风寒所致的小儿咳嗽临床疗效确切。处方由化橘红、鞘蕊苏、紫苏叶等5味中药组方，具有宣肺解表散寒、理气化痰止咳之功效，用于小儿风寒咳嗽症，症见咳嗽频作、咳痰稀白、鼻流清涕、恶寒无汗、头身疼痛、舌淡苔白、脉浮紧、指纹色淡。鞘蕊苏为方中为臣药，是唇形科植物毛喉鞘蕊花Coleus forskohlii（Willd．）Briq．的干燥全草，具有下气平喘、平肝之功，用于喘咳、眩晕、目胀昏花，如支气管哮喘、咳嗽、青光眼、高血压［1］。滇产毛喉鞘蕊花中主要成分为异佛司可林（isoforskilin）［2］，是目前所知的腺苷酸环化酶激活剂，即不通过受体，亦不通过抑制磷酸-Ⅱ酶，可直接提高血浆中环磷酸腺苷（cAMP）水平，直接舒张支气管平滑肌，从而起到明显的止喘抗炎作用［3-4］。异佛司可林在鞘蕊苏药材中含量较低，且无紫外吸收，在复方中鲜有将其作为检测指标的报道，但其作为处方中的药效成分，有必要对其含量测定方法进行考察，为提取工艺研究优选最佳工艺参数提供依据。

1 仪器与试药

1．1 仪器

LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；2000-ES型蒸发光散射检测器（美国奥泰公司）；204AL型电子天平（德国梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1．2 试药

异佛司可林对照品（美国Sigma公司，批号为A04016-13072506，含量按97．8%计）；水为娃哈哈纯净水；色谱甲醇、乙腈均由湖北昌泰兴业科技有限公司提供；柱层析用硅胶（100～200目，化学纯，青岛海浪硅胶干燥剂有限公司）；甲醇，乙酸乙酯、二氯甲烷均为分析纯，由国药集团化学试剂有限公司提供；苏苏小儿止咳颗粒70%醇提液、鞘蕊苏阴性样品均为武汉药谷科技开发有限公司自制。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱（150 mm×4．6 mm，5μm）；柱温：40℃；流动相：乙腈-2．5%冰醋酸溶液（40∶60，V／V）；流速：1．0 mL／min；进样量：5μL，10μL（外标两点法）；2000-ES型蒸发光散射检测器，汽化温度：103℃，氮气流速：2．8 L／min。

2．2 溶液制备

对照品溶液：取异佛司可林对照品11．98 mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制得0．468 6 mg／mL的对照品贮备液；精密吸取5 mL贮备液置25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度线，摇匀，得0．093 7 mg／mL的对照品溶液。

供试品溶液：取苏苏小儿止咳颗粒70%醇提液（按处方比例分别称取化橘红、鞘蕊苏、紫苏叶、桔梗各50 g，甘草25 g，加10倍量70%乙醇，提取2次，每次1 h，滤过，合并滤液，即得）150 mL，精密称定，置水浴上蒸干，残渣加水30 mL加热使溶解，用二氯甲烷振摇提取4次，第1次30 mL，其余3次每次20 mL，合并二氯甲烷液，加水50 mL洗涤，弃去水液，回收溶剂至约5 mL，加入硅胶（100～200目）1．0 g，拌匀，挥干，移至硅胶柱（内径1．5 cm，硅胶8 g，湿法装柱）上，先用二氯甲烷-乙酸乙酯（9∶1，V／V）80 mL洗脱，弃去洗脱液，再用二氯甲烷-乙酸乙酯（75∶25，V／V）100 mL洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，用甲醇溶解并转移至5 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

阴性对照品溶液：按处方比例称取除鞘蕊苏外的其他药材，按苏苏小儿止咳颗粒70%醇提液的制备工艺制成阴性样品，再按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2．3 方法学考察

专属性试验：精密量取对照品溶液、阴性供试品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见图1。可见，阴性对照品溶液色谱在与异佛司可林相应位置上无吸收峰出现，异佛司可林与其他成分色谱峰达到基线分离。

图1 高效液相色谱-蒸发光散射色谱图

线性关系考察：取对照品溶液，分别进样1，3，5，7，10，15，20μL，按拟订色谱条件测定，以进样量的常用对数值为横坐标（X）、峰面积的常用对数值为纵坐标（Y）绘制标准曲线，线性回归方程为Y＝1．715X＋5．504 6，r＝0．999 8（n＝7）。结果表明，异佛司可林进样量在0．093 7～1．874 0μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取同一对照品溶液，按拟订色谱条件进样5μL，连续进样6次，记录色谱图，计算色谱峰峰面积对数。结果RSD为0．14%（n＝6），表明仪器精密度较好。

稳定性试验：取同一份供试品溶液，分别在制备后0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h时按拟订色谱条件进样测定。结果异佛司可林色谱峰峰面积对数的RSD为0．28%（n＝13），表明供试品溶液在常温下放置24 h稳定性良好。

重复性试验：平行制备6份供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果异佛司可林的平均含量为2．002 4μg／g，RSD为1．37%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品溶液（含量为2．002 4μg／g）6份，每份约75 mL，精密称定，置蒸发皿中，精密加入83．325μg／mL的对照品溶液2 mL，置水浴上蒸干，制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果见表1。

表1 异佛司可林加样回收试验结果（n＝6）

2．4 工艺研究样品测定

鞘蕊苏在本处方中为臣药，拟以其所含主要成分异佛司可林为指标成分，对不同浓度乙醇提取液进行检测，得出指标成分转移率高的较优乙醇浓度范围，再在此范围内进行正交试验，以提取次数（因素A）、提取时间（因素B）、加醇量（因素C）、乙醇浓度（因素D）确定优化后的提取条件，并进行正交验证试验，确定最优提取条件。异佛司可林提取转移率＝（各提取液中异佛司可林的含量×对应提取液的质量）／（鞘蕊苏异佛司可林含量×鞘蕊苏的投料量）×100%。结果见表2至表6。结合君药化橘红中柚皮苷的转移率，确定苏苏小儿止咳颗粒提取正交试验乙醇浓度为60%～80%。可见，提取次数和加醇量对异佛司可林转移率有显著影响，最优提取条件为A3B2C3D2；提取3次与2次相比，加醇量10倍与12倍，异佛司可林的提取转移率相差均不大，从工业生产结合能源耗损来分析，臣药鞘蕊苏中异佛司可林最佳提取条件为A2B2C2D2。各验证试验提取液的异佛司可林提取转移率均大于75%，RSD小于2．0%，表明提取2次，加醇量为10倍能将有效成分提取完全。故确定最佳提取工艺条件为：加10倍量70%乙醇，回流提取2次，每次1．5 h。

表2 工艺提取预试验异佛司可林的测定结果

表3 醇提因素水平表

表4 醇提正交试验结果

表5 异佛司可林转移率方差分析表

表6 醇提正交验证工艺异佛司可林转移率试验结果

3 讨论

处方中鞘蕊苏有效成分异佛司可林只有紫外末端吸收，目前对鞘蕊苏异佛司可林含量测定报道主要有2种方法：一是选用紫外检测器测定，采用末端吸收波长210 nm［5-6］；二是采用高效液相色谱-蒸发光散射（HPLC-ELSD）法，使用流动相乙腈-水系统［7］。采用紫外检测波长210 nm测定时，由于异佛司可林含量低、杂质峰相对较大，无论是调节流动相比例还是调节流动相酸度、柱温，都无法将主峰与杂质峰分开。采用HPLCELSD，使用流动相乙腈-水系统时异佛司可林主峰与杂质峰完全重合，阴性样品有干扰。该2种方法对苏苏小儿止咳颗粒样品的分离度有限，阴性样品总会有干扰。本研究中以HPLC-ELSD法测定异佛司可林含量时，在流动相中加入挥发性的酸，使本来与主峰重叠的杂质峰，得到了完全分离，分离效果得到极大改善，方法可行。

关于鞘蕊苏中异佛司可林含量测定，按2015年版《中国药典（四部）》通则0512中高效液相色谱法测定。分别精密吸取对照品溶液5，10μL，供试品溶液5～10μL，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法常用对数方程计算即得。本品按干燥品计算，含异佛司可林（C22H34O7）不得少于0．01%。工艺研究中各试验样品投料用鞘蕊苏异佛司可林含量按本法测定为151．7μg／g。

苏苏小儿止咳颗粒样品中异佛司可林含量相对较低，要达到检测要求，取样量较大，直接浓缩加硅胶拌匀时发现样品黏性较强，呈团块状不易分散，加至硅胶柱上时干扰洗脱，故根据异佛司可林的溶解性，以有机溶剂萃取纯化，但萃取后的样品中仍含有较多杂质，颜色较深，对异佛司可林的测定产生干扰，且易降低色谱柱的柱效和使用寿命，因而仍有必要进一步通过硅胶柱对萃取后的样品进行纯化。以二氯甲烷-乙酸乙酯不同比例混合，进行梯度洗脱，通过系列对比试验确定了硅胶柱的内径、用量，以及二氯甲烷-乙酸乙酯洗脱剂的最佳用量。以上研究方法为中药新药研发过程中相对含量较低的复杂成分的质量控制提供了一定的研究思路。