金槐痔瘘合剂的质量标准提升及应用*

陈晓双，马 静，费小凡，宋 毅

（四川大学华西医院临床药学部，四川 成都 610041）

金槐痔瘘合剂为院内制剂，属中药复方制剂，功能为清热解毒、凉血止血，主要用于治疗痔疮、出血和疼痛等。金槐痔瘘合剂现行质量标准由四川省食品药品监督管理局发布，标准文号为SZBZ20080892-10（Z）。槐花、地榆均为处方中的臣药，槐花具有清热、凉血、止血等功效，对尿血、痔疮出血等具有显著疗效［1］，其主要有效成分为黄酮类化合物芦丁，常用于防治高血压、出血性疾病等，也可用于治疗痔疮［2-4］；地榆性寒，有凉血止血，清热解毒，消肿敛疮之功效［5］。目前，该制剂仅有金银花、黄柏和芍药的薄层色谱（TLC）鉴别法，无含量测定项，不能准确定量，质量可控性较差。为了加强该制剂的质量控制，更好地保证临床疗效，故本研究中新增了地榆和槐花的TLC鉴别，并采用高效液相色谱（HPLC）法对芦丁进行含量测定及方法学考察［6-7］。现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

LC-10AT型高效液相色谱仪，CTO-10AS型柱温箱，SCL-10AT型处理器，SPD-10AVP型检测器，均购自日本岛津公司；ZF-90型多功能暗箱式紫外透射仪（上海宝山顾村电光仪器厂）；XP205DR型电子分析天平（METTLER TOLEDO公司，十万分之一）。

1．2 试药

金槐痔瘘合剂（自制，批号为170327，170531，170703，规格为每瓶500 mL）；地榆对照药材（批号为121286-200402），槐花对照药材（批号为121063-201003），没食子酸对照品（批号为110831-200803，质量分数为90．1%），芦丁对照品（批号为100080-200707），均购于中国药品生物制品检定所。硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂，规格为100 mm×200 mm）；甲醇为色谱纯，石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯、三氯甲烷等其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2．1 TLC鉴别

2．1．1 地榆［8-9］

分别取3批金槐痔瘘合剂10 mL，水浴浓缩至约3 mL，加50%甲醇溶液20 mL，加热回流提取1 h，放冷，滤过，滤液用乙醚振摇提取2次，每次20 mL，合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇2 mL使溶解，即得供试品溶液。另取地榆对照药材0．5 g，同法制备对照药材溶液。取没食子酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0．5 mg的对照品溶液。按处方取除地榆之外的其他药材，照金槐痔瘘合剂制备工艺，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

照2015年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC法［10］，吸取供试品溶液和对照药材溶液10μL，对照品溶液和阴性对照溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸（7∶5∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铁乙醇溶液，日光下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品、对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰（见图1 A）。

图1 薄层色谱图

2．1．2 槐花［11-12］

分别取3批金槐痔瘘合剂3 mL，加石油醚（60～90℃）振摇提取3次，每次10 mL，弃去石油醚液，水液加甲醇30 mL加热回流30 min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇溶解，即得供试品溶液。取槐花对照药材0．5 g，加甲醇10 mL，超声处理30 min，滤过，滤液水浴浓缩至约2 mL，即得对照药材溶液。取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0．2 mg的对照品溶液。按处方取除槐花之外的其他药材，照金槐痔瘘合剂制备工艺，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

照2015年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC法［7］，吸取供试品溶液和对照品溶液各5μL，对照药材溶液和阴性对照溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-冰乙酸-水（5∶1∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三氯化铝溶液，在365 nm下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品、对照药材溶液色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰（见图1 B）。

2．2 含量测定［13-15］

2．2．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Diamonsil C18柱（150 mm×4．6 mm，5μm）；流动相：甲醇-0．4%磷酸水溶液（45∶55）；流速：1 mL／min；柱温：35℃；检测波长：257 nm；进样量：10μL。在上述色谱条件下分析，与相邻组分峰的分离度均大于1．5。

2．2．2 溶液制备

取芦丁对照品1 mg，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0．1 mg的溶液，0．45μM微孔滤膜过滤，制得质量浓度为0．082 mg／mL的对照品溶液。精密量取金槐痔瘘合剂上清液2 mL，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，称定质量，加热回流2 h，放冷，再称定质量，75%甲醇补足质量，0．45μM微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。同供试品溶液制备法分别按照制剂处方配比，制备缺槐花的阴性对照溶液。

2．2．3 方法学考察

专属性考察：精密吸取芦丁对照品、供试品及阴性对照溶液适量，按拟订色谱条件分别进样10μL，记录色谱图，见图2。结果表明，供试品溶液色谱峰与对照品溶液色谱峰的保留时间一致，且阴性对照无干扰，表明方法专属性良好。

线性关系考察：分别精密量取质量浓度为0．328 mg／mL的芦丁对照品贮备液1 mL，甲醇梯度稀释至终质量浓度分别为0．328 0，0．164 0，0．082 0，0．041 0，0．020 5，0．010 3 mg／mL的芦丁对照品溶液，定量至1 mL。分别吸取上述溶液各10μL注入液相色谱仪，测定峰面积值。以进样量（X，mg）为横坐标、峰面积值（Y）为纵坐标，得芦丁回归方程Y＝2×107X＋27 183，r＝0．999 7（n＝6）。结果表明，芦丁进样量在0．010 3～0．328 0 mg范围内与峰面积值线性关系良好。

图2 高效液相色谱图

精密度测定：取芦丁对照品溶液，按拟订色谱条件重复进样6次，测定峰面积值。结果芦丁峰面积的RSD为0．054%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液（批号为170703），室温下放置，分别于0，1，2，4，8，10 h时按拟订色谱条件进样测定峰面积值。结果芦丁峰面积的RSD为0．013%，表明供试品溶液室温下放置10 h内稳定。

重复性试验：精密量取同一样品（批号为170703），依法平行制备5份供试品溶液，并按拟订色谱条件进样测定。结果含量的RSD为0．012%，表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密量取已知含量的供试品（批号为170703，含芦丁0．079 0 mg／mL）共6份，分别加入一定质量浓度的芦丁对照品溶液1 mL（相当于金槐痔瘘合剂中原有质量的100%），依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n＝6）

2．2．4 样品含量测定

取3批样品（批号为170327，170531，170710），依法平行制备3份供试品溶液，按拟订色谱条件进样，测定峰面积值，计算芦丁含量。结果芦丁对照品的芦丁含量为0．164 mg／mL，各批次样品的芦丁含量分别为0．133，0．129，0．132 mg／mL（n＝3）。

3 讨论

本研究中分别考察了地榆不同展开剂、点样量及不同检视条件，比较了三氯甲烷-甲醇（4∶1）、环己烷-乙酸乙酯-甲酸（7∶5∶1）展开剂的展开结果。结果显示，采用三氯甲烷-甲醇（4∶1）作为展开剂时，供试品斑点拖尾严重。以紫外光254 nm、365 nm和喷以2%三氯化铁乙醇溶液作为检视条件，喷以2%三氯化铁乙醇溶液时特征斑点最明显。对槐花薄层鉴别方法方法学考察时，同地榆考察方法，确定以乙酸乙酯-冰乙酸-水（5∶1∶2）作为本品最佳展开系统和喷以2%三氯化铝溶液，365 nm观察显色斑点。

供试品提取工艺中，比较超声、加热回流和浸泡过夜3种提取方式。结果显示，采用加热回流方式提取时，芦丁测得含量略高。不同体积分数（50%，75%，100%）甲醇溶液进行提取时，芦丁的提取含量随甲醇浓度的增加而升高，当甲醇体积分数达到75%后，提取率略有下降，故选用75%甲醇溶液作为提取溶剂。芦丁成分提取率随着时间（30，60，120 min）的增加而升高，综合考虑提取效率、能源和时间成本等因素，最终选择提取时间为120 min。

综上所述，通过对医院制剂金槐痔瘘合剂的TLC鉴别和含量测定内容进行了补充，并进行了方法学考察，完善并提升了金槐痔瘘合剂的质量标准。